Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод<em> Dictyostelium discoideum</em> Агрегацией Assays
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum амебы встречаются в почве, питаются бактериями. Когда источники питания становятся редкими, они секретируют факторы , чтобы инициировать многоклеточный программу развития, в ходе которой отдельные клетки chemotax по отношению к агрегации центров 1-4. Этот процесс зависит от высвобождения циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) 5. цАМФ вырабатывается в волнах через согласованные действия аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, и связывается с G-белком рецепторов цАМФ 6,7. Широко используемый анализ для анализа механизмов , участвующих в цикле развития нижнего эукариот Dictyostelium discoideum основан на наблюдении агрегацией клеток в условиях затопленных 8,9. Этот протокол описывает анализ роли coronin А в цикле развития голоданием в тканевой культуре пластин , погруженных в сбалансированном солевом растворе (ПБС) 10. Coronin А является членом широко законсервированного прotein семейство coronins , которые были вовлечены в самых разнообразных мероприятиях 11,12. Dictyostelium клетки , лишенные coronin А не способны образовывать многоклеточные агрегаты, и этот дефект может быть спасен путем подачи импульсов цАМФ, предполагая , что coronin А действует выше по потоку от цАМФ каскад 10. Методы , описанные в этих исследованиях , обеспечивают надежные инструменты для исследования функции белков на начальных стадиях цикла развития Dictyostelium discoideum вверх по течению от цАМФ каскада. Поэтому, используя этот анализ агрегации может позволить дальнейшее изучение coronin функции и улучшения нашего понимания coronin биологии.
Introduction
Coronin семейство белков высоко законсервирован на протяжении эукариот. Эти белки характеризуются наличием амино-концевой триптофан-аспартата (WD) повторяют , содержащие область, уникального региона , подключенного к карбокси-концевой домен биспиральных 13,14 (рисунок 1). Coronins участвуют в различных клеточных функций, включая регулирование цитоскелета и сигнальной трансдукции 12. У млекопитающих, вплоть до шести коротких coronin молекул (coronin 1-6), а также 'тандем' coronin 7, могут быть совместно выражены 12,15. Coronin 1 является наиболее широко изучены член семьи, и было показано, участвует в разрушении болезнетворных микроорганизмов, выживание Т-клеток и нейронного сигнала. Как именно, coronin 1 осуществляет эту деятельность, остается неясным. В то время как coronin 1 было показано, регулирует Ca 2+ и цАМФ-зависимого сигнализации, а также F-актин цитоскелета модуляции 16-18 потенциал сотрудничества-expression до 7 членов семьи у млекопитающих сделало его сложным для изучения молекулярной функции coronins в этих системах, из-за возможных увольнений. В отличие от млекопитающих организмов, нижняя эукариот Dictyostelium discoideum выражает только два coronin членов семьи (coronin A, ортологом млекопитающих coronin 1 и coronin B, ортологом coronin млекопитающих 7) , по- видимому , не избыточных функций 15,19,20. Этот факт делает Dictyostelium discoideum мощную модель для изучения функции coronins.
Изучить роль coronin А в Dictyostelium discoideum, мы побудила цикл развития от голода в тканевых культуральных планшетах , содержащих сбалансированный солевой раствор (BSS) буфер , используя либо клетки дикого типа или клетки , лишенные coronin A 10. Мы обнаружили, что клетки, лишенные coronin К оказались не в состоянии сформировать многоклеточные агрегаты при голодании. Для точного количественной оценки этого фенотипаавтоматизированный клеток изображений живых описано в данном протоколе, является жизненно важным инструментом. Дефект в инициации раннего ответа голодном в клетках, лишенных coronin А может быть спасен путем подачи импульсов цАМФ, предполагая, что coronin А действует вверх по течению от цАМФ каскада. Экзогенные применение цАМФ импульсов для имитации инициации развития была использована несколько лабораторий в прошлом 8,9. Тем не менее, эта процедура также известно, сильно зависит от плотности клеток и времени. Таким образом, протокол, описанный здесь, имеет целью уменьшить эти изменчивости, чтобы гарантировать высокую степень воспроизводимости. Взятые вместе, методы , используемые в этих исследованиях , обеспечивают надежные инструменты для исследования функции белков на ранних стадиях цикла развития Dictyostelium discoideum и имеют потенциал , чтобы определить вверх, а также вниз по течению эффекторов coronin функции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В coronin белки встречаются в большинстве таксонов эукариотических клады. Dictyostelium discoideum coronin А, гомолог coronin млекопитающих 1, участвует в ранней реакции голодной, так как coronin А-дефицитные клетки не способны образовывать агрегации центров во время раннего развития цикл 10. Для того…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
