Préparation et analyse des<em> In vitro</em> Trois Breast Dimensional Carcinome Surrogates

Summary

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Abstract

Trois dimensions de la culture (3D) est une méthode plus physiologiquement pertinents pour modéliser le comportement des cellules in vitro que deux cultures dimensionnel. Les cancers, y compris les cancers du sein sont des tissus 3D complexes composées de cellules cancéreuses épithéliales et stromales de composants, y compris les fibroblastes et la matrice extracellulaire (ECM). Mais la plupart des modèles in vitro de cancer du sein sont constitués uniquement de cellules epitheliales cancéreuses, en omettant le stroma et, par conséquent, l'architecture en 3D d'une tumeur in vivo. modélisation 3D appropriée du cancer est important pour la compréhension précise de la biologie de la tumeur, le comportement et la réponse au traitement. Toutefois, la durée de la culture et le volume des modèles 3D est limitée par la disponibilité de l'oxygène et des nutriments dans la culture. Ici, nous démontrons une méthode dans laquelle les cellules de carcinome du sein épithéliales et les fibroblastes du stroma sont incorporés dans l'ECM pour générer une porteuse de cancer du sein en 3D qui comprend stroma et peuvent être cultivées en tant questructure 3D solide ou en utilisant un système de bioréacteur à perfusion pour délivrer de l'oxygène et de nutriments. Après l'installation et une période de croissance initiale, les substituts peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues préclinique. En variante, les composants cellulaires et de la matrice de la mère porteuse peuvent être modifiés pour répondre à une variété de questions biologiques. Après la culture, les mères porteuses sont fixées et traitées à la paraffine, d'une manière similaire à la manipulation d'échantillons de carcinome du sein clinique pour l'évaluation des paramètres d'intérêt. L'évaluation de l'un de ces paramètres, la densité de cellules présentes, il est expliqué, le cas des systèmes logiciels d'analyse d'image et ImageJ CellProfiler sont appliqués à des photomicrographies des coupes histologiques de mères porteuses pour quantifier le nombre de cellules nucléées par zone. Ceci peut être utilisé comme un indicateur de la variation du nombre de cellules au cours du temps ou la variation du nombre de cellules résultant de différentes conditions de croissance et les traitements.

Introduction

Trois modèles (3D) de culture de dimensions qui imitent plus précisément l'architecture de la tumeur et microenvironnement in vivo sont importantes pour des études visant à disséquer les interactions complexes entre les cellules et leur microenvironnement et pour tester l'efficacité des thérapies candidates. Tumeur impacts dimensionnalité de l' oxygène et des gradients de nutriments, l'uniformité de l' exposition au médicament, interstitielle débit / pression sanguine, et de l' architecture 3D ^1-4. La présence d'un micro-environnement stromal approprié contribue à la dimensionnalité des tumeurs et des influences de signalisation cellule-ECM et la signalisation entre paracrine des cellules stromales et les cellules épithéliales malignes. Les effets de la dimensionnalité de la tumeur et le microenvironnement sur ​​la fonction cellulaire sont bien établis, avec les deux facteurs altérant la réponse aux médicaments ^1,3,5-8. En outre, la cinétique cellulaire de croissance, les taux métaboliques, et la signalisation cellulaire diffèrent entre les deux (2D) la culture et de la culture dimensionnelle en 3D, avec ces facteurs affection réponse cellulaire ^1,3,8-10.

In vitro, la tumeur microenvironnement porteuse peut être modulée en incluant des composantes représentatives de la MEC et les populations de cellules stromales. Les cellules épithéliales malignes sont influencées par l'ECM et les cellules stromales associées au cancer soit d'une manière synergique / protecteur pour favoriser la progression tumorale ou d'une manière suppressive pour inhiber la propagation ultérieure de la tumeur ^5,6,10. Dans les deux contexte, le stroma peut affecter la réponse thérapeutique et la délivrance de médicaments par l' intermédiaire d'une signalisation paracrine et / ou en augmentant la pression interstitielle dans la tumeur , entraînant une diminution de l' administration de médicaments à ^1,6. Par conséquent, l'ajout de l'ECM et les cellules stromales dans des modèles précliniques aidera récapituler les aspects de la tumeur qui ne peut pas être bien modélisé dans la culture 2D.

Ici une méthode pour établir des substituts du cancer du sein qui incorporent un microenvironnement récapitulatifs, y compris les composants et s ECMtromal cellules dans un volume 3D est décrit. Dans le cancer du sein, la population de cellules stromales est principalement constitué de fibroblastes associés au cancer (FAC) et l'ECM stromales se compose essentiellement de collagène de type I avec une faible proportion de composants de la matrice que l'on trouve dans la membrane basale, y compris la laminine et du collagène de type IV ^1,4,11-13. Par conséquent, ces composants du microenvironnement de carcinome du sein (c. -à- CAF, le collagène I, et la membrane basale) ont été incorporés dans les mères porteuses. Cette méthode peut être utilisée pour générer des solides, des substituts de l' ONU 3D perfusé (figure 1A) ou peut être adapté pour inclure la perfusion du milieu à travers le substitut par l' intermédiaire d' un système de bioréacteur (figure 1B). Les deux approches sont décrites ici. Cette méthode peut également être modifiée pour inclure d'autres éléments du stroma, telles que les macrophages associés aux tumeurs, ou pour modéliser d'autres tumeurs solides en ajustant les composants cellulaires et ECM, le cas échéant.

<pclass = "jove_content"> Pour la substitution de carcinome du sein décrit ici, nous avons utilisé la MDA-MB-231 (231) , la lignée cellulaire de cancer du sein, CAF précédemment isolé du carcinome du sein humain ^14, et un ECM composé de 90% de collagène I ( le facteur de croissance matériau 6 mg / ml) et 10% de sous-sol réduite membrane (BM). Le substitut est soit cultivé dans un 8 puits lame de chambre (substitut solide) ou un système de bioréacteur est utilisé pour fournir une perfusion de nutriment continue (substitution perfusé). Tout système de bioréacteur à perfusion qui peut accueillir un volume de cellules ECM contenant peut être utilisé ^15. A titre d'exemple, nous décrivons la préparation des succédanés de tissus dans le système de bioréacteur. Ce système a été développé en interne et ne sont pas disponibles dans le commerce. Parce que notre accent est mis sur la préparation et l'analyse des substituts de tissu 3D, nous ne sommes pas allés dans de nombreux détails sur les spécificités de la fabrication et l'assemblage de notre système de bioréacteur. Toutefois, une description détailléece système et son développement a été publié le ^16. Dans ce système de bioréacteur, un canal d'écoulement (PDMS) est utilisé pour loger la porteuse, qui est supporté par une mousse de PDMS (formé en utilisant des procédés similaires à ceux décrits par Calcagnile et al. ^17). Ce volume est traversé par des microcanaux 4 (chacun de 400 um de diamètre) qui sont continuellement perfusées par du milieu par l'intermédiaire d'une pompe à microphysiologic pour fournir de l'oxygène et des nutriments à la substitution.

Une analyse appropriée des mères porteuses est crucial d'obtenir des informations pertinentes concernant la fonction cellulaire en réponse à un traitement ou d'autres manipulations. Les substituts peuvent être analysés par différents procédés, y compris l'imagerie directe des mères porteuses intactes par microscopie confocale ou d'autres moyens d'imagerie non invasive, l'analyse cellulaire indirecte par dosage du milieu conditionné ou perfusé, pour les produits sécrétés, ou des analyses sur des coupes histologiques après la fixation et le traitement àparaffine. Un tel paramètre qui peut être évalué sur des coupes histologiques est la densité cellulaire. Nous présentons une approche pour mesurer la densité cellulaire ( à savoir, le nombre de cellules nucléées par section zone) en utilisant des techniques de traitement d' image semi-automatisés appliqués aux photomicrographies des coupes histologiques de substitution colorées à l' hématoxyline et l' éosine (H & E). La densité cellulaire peut être utilisée comme un indicateur de la variation relative du nombre de cellules au cours du temps ou qui résulte de différentes conditions de croissance et les traitements.

Figure 1. Volume 3D et système de bioréacteur. A) Schéma du processus pour produire des substituts 3D solides. Top: bande dessinée de volume 3D solide contenant ECM (rose), des cellules de carcinome épithéliales (jaune) et CAF (orange); Bottom:. Vue de dessus de 8 puits chambre diapositive contenant des substituts B) Schéma du processus pour générer perfusé mères porteuses 3D. Top: cartoon de volume 3D avec des canaux pour permettre perfusion de milieu et contenant ECM (rose), des cellules de carcinome épithéliales (jaune) et CAF (orange); Moyen: image de canal d'écoulement PDMS contenant de la mousse PDMS (flèche noire) à injecter avec la cellule + ECM et pénétrée par des fils d'acier inoxydable enduites de polymère (flèche rose) mesurant 400 m de diamètre; En bas:. L' image du canal d'écoulement de PDMS contenant une mère porteuse et connecté au système de bioréacteur pour permettre une perfusion de milieu continu (pompe péristaltique et le réservoir de support non représenté) , C) , les images des étapes de traitement pour les mères porteuses solides et perfusées après la culture. Gauche: image du cryomoule contenant l'échantillon de traitement du gel et de substitution; Moyen: l'image d'un bloc de paraffine contenant un substitut fixe et traité; A droite:. Image d'une lame de verre avec une coupe histologique H & E teinté d'un substitut S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneune plus grande version de ce chiffre.

Protocol

1. Culture cellulaire Décongeler composante BM nuit à 4 ° C, sur la glace. milieu chaud à 37 ° C. Pour soutenir la croissance des deux 231 cellules et CAF, utiliser du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) plus 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Remarque: Les supports utilisés dépendent du type de cellule et les objectifs expérimentaux. Retirer moyen de la boîte de culture (10 cm) de près de cellules confluentes 231 et ajouter 1,5 ml de trypsine / EDTA. Incuber p…

Representative Results

Deux 3D mères porteuses de cancer du sein solides et perfusées ont été préparées comme décrit ci-dessus et cultivées pendant 7 jours. Par la suite, les mères porteuses sont fixées, traitées à la paraffine, sectionnées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine comme décrit ci-dessus. Le nombre de cellules nucléées par zone (les deux cellules 231 et CAF) de chaque porteuse a été mesurée. Comme on peut le voir sur la figure 12, photomic…

Discussion

Ici, un procédé de culture en 3D a été décrite qui incorpore les composants du micro-environnement tissulaire, y compris la matrice extracellulaire (ECM) et les fibroblastes du stroma de l'homme, dans un volume plus près des modèles de cancer du sein humain pour permettre le développement d'une morphologie en 3D récapitulatif . Le procédé de culture en 3D décrit est plus représentatif de la maladie chez l'homme que la culture cellulaire traditionnelle 2D en ce que plusieurs types de cellules son…

Materials

Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)	Corning CellGro	10-014-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x	Corning	25-053-CI
Tissue Culture plates, 100mm	CellTreat Scientific Products	229620	Sterile
Tissue Culture plates, 35mm	CellTreat Scientific Products	229638	For PDMS foam formation
9" Glass pipette	Fisher	13-678-20D	Sterile
10 ml pipette	CellTreat Scientific Products	229210B	Sterile
1000 µl piptette tips	FisherBrand	02-717-166	Sterile Filtered
200 µl pipette tips	FisherBrand	02-717-141	Sterile Filtered
10 µl pipette tips	FisherBrand	02-717-158	Sterile Filtered
15 ml conical tubes	CellTreat Scientific Products	229410	Sterile
50 ml conical tubes	CellTreat Scientific Products	229422	Sterile
1.5 ml microcentrifuge tubes	FisherBrand	05-408-129	Sterile
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI	Sterile
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	24236-10	PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor.
PDMS Foam			Made in-house for use in our in-house bioreactor.
High Concentration Bovine Collagen Type I	Advanced Biomatrix	5133-A	FibriCol ~10 mg/mL
Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane)	Corning	354230	Basement membrane material
Sodium Bicarbonate	Sigma	S8761
Molecular Biology Grade Water	Fisher	BP2819-1
DMEM 10x	Sigma-Aldrich	D2429
Nunc Lab-Tek Chamber Slide System	Thermo Scientific	177402	8-well
Bioreactor			Made in-house.
Spring-Back 304 Stainless Steel—Coated with PTFE polymer	McMaster-Carr	1749T19	Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house  bioreactor system. 0.016" Diameter
BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14	Masterflex	EW-96440-14	For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in.
2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID	Cole-Parmer	EW-74906-36	For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump).
Six Channel precision micro peristaltic pump	Cole-Parmer	EW-74906-04	For use with our in-house bioreactor system
Labtainer BPC Bag – 2 Ports, Luer Lock 50mL	Thermo Scientific	​SH3065711	Example Media Reservoir
Tuberculin Syringes	BD Medical	309625	26 gauge 3/8 in. needle; Sterile
Dissecting Tissue Forceps	FisherBrand	13-812-36	5.5 inch
Mini Tube Rotator	Boekel Scientific	260750	Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753)
50 ml tube carousel	Boekel Scientific	260753	Used with mini tube rotator
Bambino  Hybridization Oven	Boekel Scientific	230301	Equipment option for surrogate rotation
HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Specimen Processing Gel described in Step 5.2
Cryomold	Andwin Scientific	4566	15 mm x 15 mm x 5 mm
Tissue Marking Dye	Cancer Diagnostics, inc.	03000P	Can be used to mark surrogates,  allowing multiple samples to be included in one tissue cassette
Hinged tissue cassettes	FisherBrand	22-272-416
Formalin	Fisher	23-245-685
GoldSeal Plain Glass Slides	Thermo Scientific	3048-002
Xylene	Fisher	X3P-1GAL
Ethanol, 200 proof (100%), USP	Decon Laboratories, Inc.	2805M
Hematoxylin	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211
Clarifier	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7401
Bluing Solution	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301
Eosin Y	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111
Cytoseal XYL mounting media	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	83124
Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5G