تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب
Summary
Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.
Abstract
Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والأمراض في العالم، بما في ذلك الولايات المتحدة حيث تمثل ما يزيد عن 780،000 حالة وفاة سنويا. 1 التاجي تكلس الشرايين وتكلس الأبهر هي السمات المميزة لمرض تصلب الشرايين ويعمل تنبؤ قوية اعتبارا من أحداث القلب والأوعية الدموية. 2- تم الإبلاغ عن 4 نوعان رئيسيان من تكلس الأوعية الدموية لدى البالغين: تكلس باطنة، يرتبط مع تصلب الشرايين، وسطي (المعروف أيضا باسم منكيبيرغ) تكلس، ويرتبط مع مرض الكلى المزمن ومرض السكري يحدث 5 باطنة تكلس في الإعداد لتراكم الدهون والبلاعم. تسلل إلى جدار الوعاء الدموي يحدث 5،6 الإنسي تكلس جدار مستقل عن تكلس باطنة، يموضع للألياف الإيلاستين أو خلايا العضلات الملساء، وغير مقترن ترسب الدهون أو تسلل بلعم. 5،7،8 دراسات عن الآليات الجزيئية لوقد اعتمدت تكلس الأوعية الدموية على أنظمة نموذج قائم على الخلايا والحيوانات. وتشمل نماذج القوارض لمرض atherocalcific الفئران التي تعاني من نقص في أي ئي E (APOE) 9،10 أو منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني (LDLR) 11 تغذت على وجبات عالية الدهون، في حين تشمل نماذج للتكلس وسطي الفئران مع مصفوفة غلا البروتين (مجان) نقص 12 أو الفئران التي تعاني بولينا إما عن طريق استئصال الكلية شبه الكامل (نموذج استئصال الكلية 5/6) أو عن طريق التعرض لاتباع نظام غذائي عالي الأدينين 13
هنا، يركز نموذج من تكلس الأوعية الدموية وسطي المرتبطة نقص مجان جرا. مجان هو بروتين الخلية الذي يمنع تكلس الشرايين. وقد تم تحديد 12 الطفرات في الجين مجان في متلازمة Keutel، وهو مرض يصيب الانسان نادر يتصف تكلس الغضاريف منتشر بالإضافة إلى brachytelephalangy، فقدان السمع، وتضيق الرئوي الطرفية 14-18 على الرغم من عدم كثيرا ما لاحظت، 19وقد وصفت تكلس متحدة المركز الشرايين متعددة في متلازمة Keutel. وترتبط 20 الأشكال الشائعة في الجين مجان البشري مع خطر متزايد للتكلس الشريان التاجي، 21-23 بينما مستويات تداول أعلى من uncarboxylated، مجان غير نشط بيولوجيا تتوقع وفيات القلب والأوعية الدموية. 24 وخلافا للبشر مع متلازمة Keutel والفئران التي تعاني من نقص مجان تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية الشديدة التي تتكون من تلقاء أنفسهم تكلس الشرايين على نطاق واسع ابتداء من اسبوعين من العمر ويموت 6-8 أسابيع بعد الولادة بسبب تمزق الشريان الأورطي. 12
على عكس APOE – / – وLDLR – / – الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون، التي تنمي تكلس الأوعية الدموية باطنة مع المرتبطة التهاب الناجم عن بلعم، مجان – / – الفئران تطوير تكلس الأوعية الدموية وسطي في غياب تسلل بلعم 11،25 وعلى الرغم من وتشير هذه النتائج المحفزات الأساسية مختلفة لintimالقاعدة وتكلس وسطي، وهناك تداخل في آليات الإشارات التي تتوسط كلا أشكال تم تحديدها تكلس 26 مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في تكلس الأوعية الدموية بما في ذلك وسطاء التهابات مثل عامل نخر الورم α و IL-1 والعوامل المؤيدة للالمكونة للعظم مثل الشق، WNT، والبروتين المخلق للعظم (BMP) الإشارة. 27،28 تزيد هذه مسارات إشارات التعبير عن عوامل النسخ المتعلقة قزم عامل النسخ 2 (Runx2) وosterix، والتي بدورها تزيد من التعبير عن البروتينات ذات الصلة العظام ( . على سبيل المثال، أوستيوكالسين، sclerostin، والفوسفاتيز القلوية) في الأوعية الدموية التي تتوسط تكلس 28-30 نحن وغيرنا قد أظهرت أن تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في APOE – / – وLDLR – / – تغذية الفئران حمية عالية الدهون وعفوية تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان – / – الفئران وكلها تعتمد على البروتين المخلق للعظم (BMP) سيgnaling، وأنه هو هذا المسار تركز على هنا. 11،25،31 أفضل الممارسات الإدارية هي العوامل المكونة للعظم قوية المطلوبة لتكوين العظام، ومن المعروف أن تظهر زيادة التعبير في تصلب الشرايين البشرية. وقد تورط 32-34 في الدراسات المختبرية BMP الإشارات في تنظيم التعبير عن العوامل المكونة للعظم مثل Runx2. 35-37 overexpression من يجند BMP، BMP-2، ويسرع تطوير تكلس الأوعية الدموية في الفئران APOE التي تعاني من نقص تغذية نظام غذائي عالي الدهون. 38 وعلاوة على ذلك، فإن استخدام BMP محدد يشير مثبطات مثل هذه كما LDN-193189 (LDN) 39،40 و / أو ALK3-FC يمنع وضع تكلس الأوعية الدموية في كل من LDLR – / – الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون والفئران التي تعاني من نقص مجان 11،25.
الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء (VSMCs) دورا حاسما في تطوير تكلس الأوعية الدموية. 30،41،42 وتكلس الأوعية الدموية وسطي أن يتطور في مجان التي تعاني من نقص الفئران هو characterized من قبل transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. ويؤدي فقدان مجان في التعبير انخفض من علامات VSMC بما في ذلك myocardin وألفا الأكتين العضلات الملساء، مع ما يصاحب ذلك ارتفاع في علامات المكونة للعظم مثل Runx2 وosteopontin. وتتزامن هذه التغيرات مع تطور تكلس الأوعية الدموية. 25،43،44
وعادة ما يتم تقييمها تكلس الشريان الأورطي والتهاب في الفئران باستخدام تقنيات النسيجية مثل نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية للتكلس المبكر والنشاط عظمي المنشأ، فون كوسا والصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر في أواخر تكلس، والبروتوكولات المناعى التي تستهدف علامات البروتين بلعم (على سبيل المثال، CD68، F4 / 80، ماك-1، ماك-2، ماك-3). 9،45 ومع ذلك، هذه التقنيات التصوير القياسية تتطلب معالجة الأنسجة الأبهري في المقاطع العرضية، والتي هي مضيعة للوقت وغير كامل بسبب التحيز لأخذ العينات، وتقتصر في حياتهم القدرة على تحديد الالتهاب وcalcificatايون في الشريان الأورطي كله. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور وتحديد كله الأبهر والمتوسطة تكلس الشرايين وتراكم بلعم باستخدام الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) التصوير الجزيئي خارج الحي. كما قدم هو طريقة للحصاد وزراعة VSMCs الأبهر الأولية من الفئران وتحريض تكلس الفئران وVSMCs البشرية في المختبر من أجل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية تكلس. توفر هذه التقنيات المحقق مع كل من في الحي وفي أساليب المختبر لدراسة مرض atherocalcific.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكلس الشرايين هو عامل خطر مهم للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في البشر ويمكن أن تسهم بصورة مباشرة في التسبب في أحداث القلب والأوعية الدموية. وقد اقترح 1،5،52 باطنة ترسب الكالسيوم في مباراة دولية ليفية رقيقة من مرض تصلب الشرايين لزيادة التوتر النشاط الحيوي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).
Materials
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
| Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
| Elastase | Sigma | E1250 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
| Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
| Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
| Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
| Micro-dissecting spring scissors (13mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Micro-dissecting spring scissors (3mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
| ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
| Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| Tissue culture plate (35mm x 10mm) | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
| Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
| Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
| Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
- Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
- Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
- Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed?. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
- Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
- Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
- Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
- Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
- Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
- Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
- Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
- Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
- Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
- Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
- Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
- Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
- Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
- Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
- Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
- Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
- Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
- Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
- Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
- Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098 (2015).
- Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
- Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
- Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
- Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
- Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
- Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
- Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
- Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
- Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
- Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
- Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
- Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
- Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
- Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
- Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
- Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
- Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
- Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
- Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
- Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa’s reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
- Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
- Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
- Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
- Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
- Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
- Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
- Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
- Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
- Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O’Brien, K. D. Characterization of the early lesion of ‘degenerative’ valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
- New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
- Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
- Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
- Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
- Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
- Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
- Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
- Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
- Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
- Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
- Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
- Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).
