De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l'infection à VIH dans le modèle humanisé Souris
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Avec le développement rapide de la thérapie génique à base de cellules souches contre le VIH, il est urgent besoin d'un modèle animal pour étudier la différenciation hématopoïétique et la fonction immunitaire des cellules génétiquement modifiées. La moelle osseuse humanisé / Foie / Thymus (BLT) modèle de souris permet une reconstitution complète d'un système immunitaire humain à la périphérie, qui comprend les lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules NK et des monocytes. L'implant thymique humain permet également la sélection thymique des cellules T dans le tissu thymique autologue. En plus de l'étude de l'infection par le VIH, le modèle se présente comme un outil puissant pour étudier la différenciation, le développement et la fonctionnalité des cellules dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Nous exposons ici la construction de humanisé non obèse diabétique (NOD) -severe immunodéficientes combinée (SCID) gamma -common chaîne knockout (c γ – / -) -Bone-moelle / Foie / Thymus (NSG-BLT) souris avec CSH transduites avec CD4 récepteur d'antigène chimérique (CD4CAR)vecteur lentivirus. Nous montrons que la CD4CAR CSH peut réussir à se différencier en plusieurs lignées et ont une activité anti-VIH. Le but de l'étude est de démontrer l'utilisation du modèle de la souris NSG-BLT comme modèle in vivo de l' immunité d' ingénierie contre le VIH. Il est intéressant de noter que, parce lentivirus et les tissus humains sont utilisés, les expériences et les chirurgies doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II dans un niveau de biosécurité 2 (NSB2) avec des précautions particulières installation (NSB2 de +).
Introduction
Malgré le succès de la thérapie anti-rétrovirale combinée, l'infection au VIH est encore une maladie chronique. La réponse immunitaire cellulaire contre le VIH joue un rôle très important dans le contrôle de la réplication du VIH. Les progrès récents dans la manipulation de cellules souches a permis le développement rapide de la thérapie génique approches pour le traitement du VIH 1-3. Par conséquent, il est important de disposer d' un modèle animal approprié qui permet étude in vivo de l'efficacité des thérapies basées sur les cellules contre le VIH.
En travaillant avec le VIH dans des modèles animaux est compliquée par le fait que le virus infecte uniquement les cellules humaines. Pour contourner cette limitation, les scientifiques ont eu recours à l' aide de modèles de maladies comme le virus de l' immunodéficience simienne (SIV) chez le macaque rhésus 4,5. Malheureusement, il y a des limites importantes sur ce modèle en raison des différences inhérentes entre les espèces et les différences entre les SIV et le VIH. En outre, seuls les établissements hautement spécialisés sont capable de soutenir le travail avec des primates non humains et chaque macaque nécessite un investissement important. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour un modèle qui utilise le système immunitaire humain, qui est sensible à l'infection par le VIH / pathogenèse, et il est moins prohibitif.
Le non-obèses diabétiques (NOD) -severe immunodéficientes combinée (SCID) gamma -common chaîne knockout (c γ – / -) (ou NSG) Sang / Foie / Thymus (BLT) modèle de souris humanisé est de plus en plus avéré être un outil important pour étudier l'infection à VIH. Par l' implantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et thymus foetal, les souris sont capables de développer et de récapituler un système immunitaire humain 1-3. Un type de thérapie génique à base de cellules souches implique '' rediriger les cellules T périphériques pour cibler le VIH en reprogrammant cellules souches hématopoïétiques (CSH) de se différencier en lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Nous avons montré précédemment que les CSH d'ingénierie avec un anti-VIH spécifique re T cellulaire et moléculaire clonéceptor (TCR) contre l'épitope SL9 (acides aminés 77-85; SLYNTVATL) du VIH-1 Gag peut rediriger les cellules souches en cellules formant T matures qui suppriment la réplication du VIH dans le modèle de la souris NSG-BLT humanisé 6. La mise en garde d'utiliser un clone moléculaire de TCR est qu'elle est limitée à un antigène de leucocyte humain (HLA) de sous-type spécifique qui limite l'application de cette thérapie. récepteurs d'antigènes chimériques (CAR), d'autre part, peuvent être universellement appliquées à tous les sous-types HLA. Les premières études ont été effectuées en utilisant un CAR construit avec les domaines extracellulaire et transmembranaire de CD4 humaine fusionné au ζ domaine intracellulaire de CD3 de signalisation (appelé le CD4ζCAR). CD4ζCAR exprimé sur les lymphocytes T CD8 peuvent reconnaître l' enveloppe du VIH et de déclencher une réponse des lymphocytes T cytotoxiques qui est similaire à celle médiée par un récepteur de lymphocyte T 7. Nous avons récemment démontré que les CSH humaines peuvent être modifiés avec CD4ζCAR, qui peut alors se différencier en plusieurs hématopoïétique lineages, y compris les lymphocytes T fonctionnels capables de supprimer la réplication du VIH dans le modèle de souris humanisée 8. Avec les progrès rapides dans les thérapies du récepteur de l' antigène chimérique pour le cancer 9, ainsi que la caractérisation continue des grands anticorps neutralisants puissants 10-12 contre le VIH qui permettent à la construction d' une seule chaîne RAC d'anticorps, il est perceptible que de nombreuses nouvelles constructions candidates, en plus CD4ζCAR seront générés et testés pour la thérapie génique à base de cellules souches de maladies associées au VIH et d'autres maladies. En outre, le modèle de la souris NSG-BLT humanisé contenant ces RAC spécifiques de l' antigène peut également fournir un outil utile pour examiner de près les réponses des lymphocytes T humains in vivo. Surtout, notre protocole diffère des procédés précédemment décrits pour la construction de humanisé de souris BLT 13-15 en ce que les cellules souches hématopoïétiques dans un mélange de protéines gélatineux est utilisé à la place du tronc de foie foetal 16. Ce protocole décrit: 1) la construction de humanisouris BLT zed ingénierie avec CD4ζCAR; et 2) la caractérisation de la différenciation des cellules génétiquement modifiées; et 3) Caractérisation de la fonctionnalité des cellules génétiquement modifiées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec la RCA et à base HSC immunité ingénierie gagne du terrain vers les études cliniques, il est important d'avoir un modèle animal approprié d'examiner de près la différenciation et la fonction de ces cellules modifiées. Dans ce protocole, nous avons décrit les méthodes pour construire et tester des souris humanisées avec des cellules souches génétiquement modifiées génétiquement contre le VIH. Il est important d'avoir une transduction efficace de cellules souches avant la transplantation. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
