De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Com o rápido desenvolvimento de terapias baseadas em genes de células estaminais contra o HIV, não é requisito para pressionar um modelo animal para estudar a diferenciação hematopoiética e a função imunológica das células geneticamente modificadas. A medula humanizado / fígado / timo (BLT) modelo do rato permite a total reconstituição de um sistema imune humano na periferia, que inclui células T, células B, células NK e monócitos. O implante de timo humano também permite a selecção tímica de células T em tecido tímico autólogo. Em adição ao estudo da infecção por HIV, o modelo fica como uma ferramenta poderosa para estudar diferenciação, desenvolvimento e funcionalidade de células derivadas de células estaminais hematopoiéticas (HSCs). Aqui destacamos a construção de humanizada não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ – / -) ratos -Bone de medula / Fígado / Thymus (NSG-BLT) com HSCs transduzidas com o receptor do antigénio quimérico de CD4 (CD4CAR)vetor lentivírus. Nós mostramos que o CD4CAR HSCs podem diferenciar com sucesso em múltiplas linhagens e têm actividade anti-HIV. O objetivo do estudo é demonstrar a utilização do modelo de rato NSG-BLT como um modelo in vivo para a imunidade projetados contra o HIV. Vale a pena notar que, devido lentivírus e tecido humano é usado, as experiências e cirurgias devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica Classe II em um Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +) instalações.
Introduction
Apesar do sucesso da terapia anti-retroviral combinada, a infecção por HIV é ainda uma doença ao longo da vida. A resposta imune celular contra o HIV desempenha um papel muito importante no controlo da replicação do HIV. Os recentes avanços na manipulação de células-tronco tem permitido para o rápido desenvolvimento da terapia genética abordagens para HIV tratamento 1-3. Como resultado, é importante dispor de um modelo animal apropriado que permita estudo in vivo da eficácia de terapias à base de células contra o HIV.
Trabalhando com HIV em modelos animais é complicada pelo facto de o vírus infecta apenas células humanas. Para contornar essa limitação, os cientistas recorreram ao uso de modelos de doenças como o vírus Simian Immunodeficiency (SIV) em macacos Rhesus 4,5. Infelizmente, há grandes limitações neste modelo devido às diferenças inerentes entre as espécies e as diferenças entre SIV e HIV. Além disso, apenas as instalações altamente especializados são capable de apoiar o trabalho com primatas não-humanos e cada macaque requer um grande investimento. Assim, existe uma necessidade premente de um modelo que utiliza o sistema imunitário humano, que seja susceptível a infecção por HIV / patogénese, e é financeiramente menos proibitivo.
O não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ – / -) (ou NSG) Blood / Fígado / Thymus (BLT) modelo de rato humanizado é cada vez mais provado ser uma ferramenta importante para estudar a infecção pelo HIV. Por implantação de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e timo fetal, os ratinhos são capazes de recapitular o desenvolvimento e um sistema imune humano 1-3. Um tipo de terapia genética baseada em células estaminais envolve 'reorientação das células T periféricas de alvo do VIH através da reprogramação de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de se diferenciar em células T específicas para o antigénio. Nós temos mostrado previamente que HSCs de engenharia com um clonado anti-HIV re específica molecular das células TCeptor (TCR) contra o epitopo SL9 (aminoácidos 77-85; SLYNTVATL) do HIV-1 Gag pode redireccionar células estaminais em células T maduras formando que suprimem a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado BLT NSG-6. A advertência do uso de um TCR clonado molecular é de que seja limitado a um subtipo específico de antigénio de leucócitos humanos (HLA) que vai limitar a aplicação desta terapia. receptores de antigénios quiméricos (CAR), por outro lado, pode ser universalmente aplicado para todos os subtipos de HLA. Os estudos iniciais foram realizados utilizando um CARRO construído com os domínios extracelular e transmembranar de CD4 humano fundidos com o domínio intracelular de ζ CD3 sinalização (denominado a CD4ζCAR). CD4ζCAR expressa em células T CD8 podem reconhecer do envelope de HIV e desencadear uma resposta de células T citotóxicas que é semelhante à que mediada por um receptor de células T 7. Nós demonstramos recentemente que hsc humanas podem ser modificados com CD4ζCAR, que pode então diferenciam-se em múltiplos Li hematopoiéticasneages, incluindo células T funcionais capazes de suprimir a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado 8. Com o rápido avanço em terapias de receptores de antigénios quiméricos para o cancro 9, e a caracterização permanente de anticorpos neutralizantes amplos 10-12 potentes contra o HIV que permitem a construção de veículos de anticorpo de cadeia simples, é perceptível que muitas novas construções de candidatos, além de CD4ζCAR , irão ser gerados e testados para a terapia genética baseada em células estaminais de doenças do HIV e outras doenças. Além disso, o modelo de rato NSG-BLT humanizado contendo estes carros antígeno-específicas também pode fornecer uma ferramenta útil para examinar de perto as respostas das células T humanas in vivo. Importante, a nossa protocolo difere dos métodos descritos anteriormente para a construção de murganhos humanizado de BLT 13-15 em que a mistura proteica em HSCs gelatinosa é usado em lugar de troncos de fígado fetal 16. Este protocolo descreve: 1) construção de humanicamundongos BLT zed projetados com CD4ζCAR; e 2) a caracterização da diferenciação das células geneticamente modificadas; e 3) a caracterização da funcionalidade das células geneticamente modificadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com CAR e baseado em HSC ganhando impulso imunidade projetado para os estudos clínicos, é importante ter um modelo animal adequado para examinar de perto a diferenciação e função destas células manipuladas. Neste protocolo, descrevemos os métodos para a construção e teste de camundongos humanizados com células-tronco geneticamente modificados projetados contra o HIV. É importante ter a transdução eficiente de células estaminais, antes do transplante. No entanto, devido à capacidade de células T a prolif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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