-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Con el rápido desarrollo de terapias génicas basadas en células madre contra el VIH, no hay presión requisito de un modelo animal para estudiar la diferenciación hematopoyética y la función inmune de las células modificadas genéticamente. El humanizado de médula ósea / del hígado / timo (BLT) modelo de ratón permite la completa reconstitución de un sistema inmunológico humano en la periferia, que incluye las células T, células B, células NK y monocitos. El implante del timo humano también permite la selección tímica de las células T en el tejido tímico autólogo. Además del estudio de la infección por VIH, el modelo se presenta como una herramienta poderosa para estudiar la diferenciación, el desarrollo y la funcionalidad de las células derivadas de células madre hematopoyéticas (HSC). Aquí describimos la construcción de humanizado diabéticos no obesos (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ – / -) ratones -Bone ósea / hígado / timo (NSG-BLT) con HSC transducidas con receptor de antígeno quimérico CD4 (CD4CAR)vector lentivirus. Se demuestra que la CD4CAR HSC puede diferenciar con éxito en múltiples linajes y tienen actividad anti-VIH. El objetivo del estudio es demostrar el uso de modelo de ratón NSG-BLT como un modelo in vivo para la inmunidad contra el VIH ingeniería. Vale la pena señalar que, dado que se utiliza lentivirus y el tejido humano, los experimentos y las cirugías deben realizarse en una cabina de bioseguridad de clase II en un nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales instalación (BSL2 +).
Introduction
A pesar del éxito de la terapia anti-retroviral combinada, la infección por VIH sigue siendo una enfermedad de por vida. La respuesta inmune celular contra el VIH juega muy importante papel en el control de la replicación del VIH. Los recientes avances en la manipulación de células madre ha permitido para el rápido desarrollo de la terapia génica enfoques para el tratamiento del VIH 1-3. Como resultado de ello, es importante tener un modelo animal adecuado que permite el estudio in vivo de la eficacia de las terapias basadas en células contra el VIH.
Trabajando con el VIH en modelos animales se complica por el hecho de que el virus sólo infecta las células humanas. Para evitar esta limitación, los científicos han recurrido al uso de modelos de enfermedades como el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV) en macacos Rhesus 4,5. Por desgracia, existen importantes limitaciones en este modelo debido a las diferencias inherentes entre las especies y las diferencias entre SIV y el VIH. Además, sólo las instalaciones altamente especializados son capable de apoyar el trabajo con los primates no humanos y macacos cada uno requiere una gran inversión. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un modelo que utiliza el sistema inmunitario humano, que es susceptible a la infección por VIH / patogénesis, y es menos económicamente prohibitivo.
El diabético no obeso (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ – / -) (o NSG) Sangre / Hígado / timo (BLT) modelo de ratón humanizado se demuestra cada vez más como una herramienta importante para estudiar la infección por el VIH. Mediante la implantación de células madre hematopoyéticas (HSC) y timo fetal, los ratones son capaces de desarrollar y recapitular un sistema inmunológico humano 1-3. Un tipo de terapia génica basada en células madre implica 'redirigir "células T periféricas a diana del VIH mediante la reprogramación de las células madre hematopoyéticas (HSC) para diferenciarse en células T específicas de antígeno. Hemos demostrado previamente que las CMH de ingeniería con un anti-VIH específicos de células T re clonado molecularCeptor (TCR) contra el epítopo SL9 (aminoácido 77 a 85; SLYNTVATL) del VIH-1 Gag puede redirigir células madre en células formadoras de T maduras que suprimen la replicación del VIH en el GSN-BLT modelo de ratón humanizado 6. La advertencia de utilizar un TCR clonado molecular es que se limita a un subtipo específico del antígeno leucocitario humano (HLA) que limitar la aplicación de esta terapia. receptores de antígenos quiméricos (CAR), por el contrario, pueden aplicarse universalmente a todos los subtipos de HLA. Se llevaron a cabo estudios iniciales utilizando un CAR construido con los dominios extracelulares y transmembrana de CD4 humano fusionado al dominio intracelular de señalización CD3 ζ (denominado el CD4ζCAR). CD4ζCAR expresa en las células CD8 T pueden reconocer envoltura del VIH y desencadenar una respuesta de células T citotóxicas que es similar a la mediada por un receptor de células T 7. Recientemente hemos demostrado que HSCs humanas se pueden modificar con CD4ζCAR, que puede diferenciarse en múltiples li hematopoyéticoneages, incluyendo las células T funcionales capaces de suprimir la replicación del VIH en el modelo de ratón humanizado 8. Con el rápido avance en las terapias de los receptores de antígeno quiméricos para el cáncer de 9, y la caracterización en curso de anticuerpos neutralizantes amplias potentes 10-12 contra el VIH que permiten la construcción de las CAR de anticuerpos de cadena única, es perceptible que muchos nuevos constructos candidatos, además de CD4ζCAR , será generado y probado para la terapia génica basada en células madre de enfermedades de VIH y otras enfermedades. Además, el modelo de ratón humanizado GSN-BLT que contiene estos coches específicos de antígeno también puede proporcionar una herramienta útil para examinar de cerca las respuestas de células T humanas in vivo. Es importante destacar que nuestro protocolo difiere de los métodos anteriores descritos para la construcción de humanizada de ratones BLT 13-15 en que el HSCs en mezcla de proteína gelatinosa se utiliza en lugar de los troncos de hígado fetal 16. Este protocolo describe: 1) la construcción de humanilos ratones BLT zed ingeniería con CD4ζCAR; y 2) la caracterización de la diferenciación de las células modificadas genéticamente; y 3) la caracterización de la funcionalidad de las células modificadas genéticamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con CAR y ganando impulso inmunidad ingeniería basada en HSC hacia los estudios clínicos, es importante tener un modelo animal adecuado para examinar de cerca la diferenciación y función de estas células modificadas. En este protocolo se describen los métodos para la construcción y prueba de ratones humanizados con células madre modificadas genéticamente manipulados contra el VIH. Es importante tener la transducción eficiente de células madre antes del trasplante. Sin embargo, debido a la capacidad de las cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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