당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기
Summary
An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 인간의 당뇨병 각막 분자 변화를 설명하고 그들이 장기 배양 각막의 아데노 바이러스 유전자 치료에 의해 완화 될 수있는 방법을 설명하는 것입니다. 당뇨병 각막 질환은 각막 신경 및 상피 창상 치유의 빈번한 이상과 당뇨병의 합병증이다. 우리는 또한 인간의 당뇨병 각막의 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 대폭 변경 식을 설명했다. 이러한 변화를 완화하기 위해, 아데노 바이러스 유전자 치료가 성공적 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) 발현의 상향 조절 및 / 또는 단백질 분해 효소의 기질 금속-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F.이 치료의 하향 조절을 사용하여 구현 된 당뇨병 각막 상처 치유를 가속화 만 윤부 줄기 세포 구획 형질 때에도. 가장 좋은 결과는 복합 치료를 얻었다. 정규화 된 줄기 세포의 이식 가능한 환자의 경우, 예를 들어도 optimizati의 제시폴리 양이온 강화제를 사용하여 줄기 세포 농축 문화 유전자 전달의에. 이 방법은 선택된 유전자뿐만 아니라, 각막 상피의 상처 치유의 다른 매개체를 위해 단지 유용한 세포 기능 줄기있다.
Introduction
당뇨병 각막 질환은 주로 퇴행성 상피 (각막)과 신경 (신경 병증) 변경을 초래한다. 그것은 종종 상피 상처 치유 및 각막 신경의 감소 1-4의 이상에 의해 명시된다. 추정 60-70%의 당뇨병 환자는 다양한 각막 문제 1,3- 있습니다. 우리의 연구는 변경된 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) (간세포 성장 인자 수용체)의 하향 조절을 포함하여 인간 당뇨병 각막에서의 발현 및 매트릭스 메탈-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F (5, 6)의 상향 조절 여러 마커 단백질을 확인 하였다. 또한 상당히 설명 인간 당뇨병 각막 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 발현이 감소하고있다.
이전의 연구에서는 당뇨병 느린 상처 치유를 보여준다 인간 당뇨병 각막 기관 배양 시스템을 사용하여, 당뇨병 변경 마커의 수준을 정상화 아데노 바이러스 계 유전자 치료제를 개발마커의 변화 및 생체 각막 -7,8- 유사한 세포 마커의 발현 감소 줄기. 변경이 지속성은 후생 유전 학적 대사 메모리 (9)의 존재로 인해 나타납니다. 이 문화 시스템은 유전자 치료에 대한 더 사용했다. 이 치료의 목표는 당뇨병 각막 (C-충족 프로토 종양 유전자) 또는 발현 증가 (MMP-10, 카 텝신 F)에서 감소 된 표현 중 하나와 마커에서 선택되었다.
아데노 바이러스 (AV) 치료는 전체 장기 배양 각막 또는 만 공막 윤부 주변 구획에 사용 하였다. 이 구획은 각막 상피를 갱신 적극적 4,10-15 상처 치유에 참여 상피 줄기 세포 항구. 여기에서, 프로토콜은 정상과 당뇨병 인간의 각막 기관 배양 상피 상처 치유, 분리 및 줄기 세포 농축 윤부 세포 배양의 특성, 및 아데노 바이러스 세포와 각막 전달 제공됩니다. 우리의결과는 향후 이식 당뇨 각막에 마커 표현과 상처 치유를 정규화이 치료의 가능성을 보여줍니다. 또한 병용 치료는 당뇨병, 각막 16-18 정상 마커 패턴 상피를 복원 할 수있는 가장 효과적인 방법임을 시사한다.
Protocol
국립 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, PA는) 합의 된 사후 건강하고 당뇨병 인간의 눈과 각막을 공급했다. NDRI의 인체 조직 수집 프로토콜은 건강 감독의 국립 연구소에 경영위원회와 제목에 의해 승인된다. 이 연구는 승인 된 시더 – 시나이 의료 센터 임상 시험 심사위원회 (IRB) 면제 프로토콜 EX-1055에 따라 진행되고있다. , 박사를 각막 외과 공동. E. Maguen와 Y 라 비노 위츠는 줄기 세포가 풍부한 각막 상피 문?…
Representative Results
우리는 각막 기관 배양 물에서, 당뇨병 성 마커 (예, 기저막 단백질과 인테그린 α3β1) 정상 및 당뇨병 사이 각막 창상 치유의 발현의 차이가 유지되도록 미리 보여 주었다. 이 배양 시스템은 유전자 변형 당뇨병 마커, C-MET, MMP-10의 수준을 정상화 치료를 목적하고, 카 텝신 F.시켰다 전체 각막 상피는 MMP-10, 카 텝신 F (…
Discussion
각막 인해 유전자 전달뿐만 아니라 효과와 부작용의 평가가 쉽게 그 표면 위치를 유전자 요법을위한 이상적인 조직 것으로 보인다. 그러나,이 방법의 강력한 임상 번역으로 인해 유전 각막 질환의 원인 및 유전자 치료 대상 24 부족한 정보를 여전히 느리다. 각막 변경을 포함하는 당뇨병 합병증은 신진 대사 메모리 (9)로 번역 자연의 대부분 성적인 될 수있다. 그 때문에, 당뇨병 조…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
Materials
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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Cite This Article
Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (110), e54058, doi:10.3791/54058 (2016).