Summary

Продвижение 3-D агрегацию FACS Очищенная тимуса эпителиальных клеток с ЕАК 16-II / EAKIIH6 самосборки гидрогеля

Published: June 27, 2016
doi:

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

Тимус является первичным лимфоидной органом, ответственным за генерацию различных слоев населения патоген-реактивная, уверенных терпимы Т-клеток, имеет важное значение для функции приобретенной иммунной системы. Это динамичный орган, в котором развивающиеся тимоциты, иммигрировал из костного мозга в качестве клеток-лимфоцитов-предшественников, мигрируют через губчатую трехмерные (3-D) матрицы тимуса стромы, подвергаются LINEAGE-спецификации и дифференциации, и в конечном счете эмигрировать в зрелых Т-клеток. Успех этого хорошо запрограммированный процесс во многом зависит от перекрестных помех между мигрирующими тимоцитов и жилых тимуса эпителиальных клеток (ТИК), преобладающей популяции вилочковой стромы, которые имеют важное значение для установления и поддержания целостности вилочковой микросреды.

На основе их анатомического расположения и уникальной функции, ТЭМ можно разделить на два подмножества: ТИКи в коре (cTECs), которые являются responность за выбор собственного MHC (главный комплекс гистосовместимости) ограничено Т-клетки (положительный выбор), а ТИК в мозговом веществе (mTECs), которые необходимы для устранения аутореактивных Т-клеток (негативный отбор) 1,2. Многие факторы (например, старение, инфекции, облучение, лекарственное лечение) может вызвать необратимые повреждения тимуса эпителия, что приводит к скомпрометированных адаптивного иммунитета. Несмотря на многочисленные попытки, восстановление функции тимуса была сложной задачей из-за трудностей, чтобы воспроизвести тимуса микросреду. Следует отметить, что вилочковой трехмерные (3-D) , конфигурация имеет решающее значение для выживания и функции ТЭМ, тогда как ТЭМ культивируют в среде 2-D быстро уменьшают экспрессию генов , критических для тимопоэз 3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) и С-концевой histidinylated аналог EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) имеют низкий молекулярный вес, амфифильные олигопептиды, которые растворяются в деионизованной водоснаг, но подвергаются гелеобразование с образованием бета-фибриллы при воздействии ионной силы выше, чем 20 мМ NaCl (нормальной концентрации соли в жидкости тела человека составляет 154 мм). Это свойство отзывчивым окружающей среды делает их универсальными строительными блоками для формирования 3D-структур. His-метки на EAKII-H6 обеспечивает стыковочный механизм, с помощью которого противопехотные Его IgGs / Fc-связывающий рекомбинантный белок A / G (αH6: пА / G) комплексы могут служить в качестве адаптера для закрепления белковых лекарственных средств и других биомолекул ( например, антитела) на гидрогеля композита 5-8.

Ранее мы показали , что флуоресцентные меченных молекул IgG , базирующуюся на гидрогеля может удерживаться в месте инъекции в течение до 13 дней 9. Кроме того, когда αH6: пА / G адаптеры с прикрепленные анти-CD4 IgG , были добавлены к EAK16 II / EAKIIH6 (ЕАК) гидрогеля, CD4 + Т – клетки были специально захваченный 10. Используя подобную технику, мы недавно показали, что 3-D агрегация TECS Cульд быть повышен в ЕАК гидрогеля с адаптером комплексов, несущих ПЭС-специфических анти-EpCAM антител (αH6: Pa / G: αEpCAM). Когда пересаживают под почки капсулы голых мышей, КТР кластеры , встроенные в ЕАК гидрогеля может эффективно поддерживать развитие функциональных Т – клеток в естественных условиях 11,12.

Здесь мы проиллюстрируем наш метод, чтобы быстро и эффективно очищают ТИК с сортировкой флуоресцентно активированных клеток (FACS) и генерировать 3-D TEC агрегаты с системой EAK гидрогеля.

Protocol

Все животные, используемые в экспериментах, были размещены в виварии в научно-исследовательском институте Allegheny-Зингера в соответствии с протоколом были рассмотрены и одобрены Institutional животных по уходу и использованию комитета / Allegheny научно-исследовательского института Allegheny Network Health…

Representative Results

Для изучения эффективности использования протокола градиента плотности разделения для обогащения стромальных клеток CD45-, клетки, полученные как из интерфейса и осажденных лимфоцитах гранул окрашивали анти-CD45 и анти-EpCAM антител. Оба анти-Улекс Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) и антит…

Discussion

В то время как ТЭМ являются преобладающими популяция вилочковой стромы и играют существенную роль для структуры и функции тимуса желез, они составляют лишь около 0,1-0,5% от общего тимуса клеточности. Они также являются хрупкими клетки , как высокий процент гибели клеток изредка наблюдаю?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения грантов R21 AI113000 (WSM) и R01 AI123392 (YF).

Materials

1. TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50mL Centrifuge tube Corning 430290
60mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 Becton Dickinson 329461
5mL Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100um Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell sorting
5mL Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2uL per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10uL per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10uL per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
Name Company Catalog Number Comments
2. EAK gel assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5mL microcentrifuge tube" 
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10mg/mL
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5mg/mL
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640  Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100X) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

References

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).

Play Video

Cite This Article
Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

View Video