Abstract
Proton-Transfer-Reaktion (PTR), kombiniert mit einem Time-of-Flight (ToF) Massenspektrometer (MS), ist ein analytischer Ansatz, der auf der chemischen Ionisation basiert, die zu den Direct-Injection Mass Spectrometric (DIMS) Technologien gehört. Diese Techniken erlauben die schnelle Bestimmung von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs), die eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit gewährleisten. Im Allgemeinen erfordert PTR-MS weder Probenvorbereitung noch Probenzerstörung, so dass eine Echtzeit- und nicht-invasive Analyse von Proben möglich ist. PTR-MS werden in vielen Bereichen von der ökologischen und atmosphärischen Chemie bis hin zu medizinischen und biologischen Wissenschaften ausgenutzt. In jüngster Zeit haben wir eine Methodik entwickelt, die auf der Kopplung von PTR-ToF-MS mit einem automatisierten Sampler und maßgeschneiderten Datenanalyse-Tools basiert, um den Automatisierungsgrad zu erhöhen und damit das Potenzial der Technik zu erhöhen. Dieser Ansatz erlaubte es uns, Bioprozesse ( zB enzymatische Oxidation, alkoholische Fermentation) zu überwachen, um große Probenmengen (ZB unterschiedliche Ursprünge, ganze Keimbläschen) und analysieren mehrere experimentelle Modi ( zB unterschiedliche Konzentrationen eines gegebenen Inhaltsstoffs, unterschiedliche Intensitäten eines spezifischen technologischen Parameters) im Hinblick auf den VOC-Gehalt. Hier berichten wir über die experimentellen Protokolle, die verschiedene Anwendungsmöglichkeiten unserer Methodik veranschaulichen: dh die Erkennung von bei der Milchsäure-Fermentation von Joghurt freigesetzten VOCs (Online-Bioprozess-Monitoring), die Überwachung von VOCs, die mit verschiedenen Apfelsorten assoziiert sind (großformatiges Screening) , Und die in vivo Studie der retronasalen VOC Freisetzung während des Kaffees trinken (Nosespace Analyse).
Introduction
Direct-Injection Mass Spectrometric (DIMS) -Technologien stellen eine Klasse von analytischen Instrumentalansätzen dar, die eine beträchtliche Massen- und Zeitauflösung mit hoher Empfindlichkeit und Robustheit bieten und so die schnelle Erkennung und Quantifizierung von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) ermöglichen. Zu diesen instrumentellen Ansätzen gehören unter anderem MS-e-Nasen, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry (APCI-MS), Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometry (PTR-MS) und ausgewählte Ionen-Flow-Tube-Massenspektrometrie ( SIFT-MS) 1 . Die Vor- und Nachteile jedes Ansatzes hängen von der Art der Probeninjektion, der Quelle und der Kontrolle der Vorläuferionen, der Kontrolle des Ionisierungsprozesses und des Massenanalysators 1 , 2 ab .
Proton-Transfer-Reaktion Massenspektrometrie (PTR-MS) wurde vor mehr als zwanzig Jahren entwickelt, um in Echtzeit und wi zu überwachenTh niedrige Nachweisgrenzen (meist ein paar ppbv, Teil pro Milliarde Volumen) am meisten flüchtige organische Verbindungen (VOCs) in Luft 3 , 4 . Die derzeitigen Verwendungen von PTR-MS reichen von medizinischen Anwendungen über die Lebensmittelkontrolle bis hin zur Umweltforschung 5 , 6 . Die Hauptmerkmale dieser Technik sind: die Möglichkeit einer schnellen und kontinuierlichen Messung, die intensive und reine Quelle von Vorläuferionen und die Möglichkeit, die Ionisationsbedingungen (Druck, Temperatur und Driftspannung) zu kontrollieren. Mit diesen Merkmalen lassen sich vielseitige Einsatzmöglichkeiten mit hohem Standardisierungsgrad 1 , 4 kombinieren. Tatsächlich beruht das Verfahren auf Reaktionen von Hydroniumionen (H & sub3 ; O & spplus; ), die einen nichtdissoziativen Protonentransfer in den meisten flüchtigen Verbindungen induzieren (insbesondere in jenen, die durch eine Protonenaffinität höher als Wasser gekennzeichnet sind), Protonen von neutralen Verbindungen(M) nach der Reaktion: H 3 O + + M → H 2 O + MH + . Im Gegensatz zu anderen Techniken, zB APCI-MS, werden die Vorläufer-Ionenerzeugung und die Probenionisation in zwei verschiedene Instrumentalfächer aufgeteilt (eine schematische Darstellung des PTR-MS-Instruments ist in Abbildung 1 dargestellt). Eine elektrische Entladung durch Wasserdampf in der Hohlkathoden-Ionenquelle erzeugt einen Strahl von Hydroniumionen. Nach dieser Phase kreuzen Ionen das Driftrohr, wo die Ionisierung von VOCs stattfindet 7 . Ionen geben dann einen Puls-Extraktionsabschnitt ein und werden in den TOF-Abschnitt beschleunigt. Durch die Flugzeiten ist es möglich, die Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse der Ionen 8 zu bestimmen. Jeder Extraktionsimpuls führt zu einem vollständigen Massenspektrum 8 des ausgewählten m / z-Bereichs. Ionenspektren werden durch ein schnelles Datenerfassungssystem 7 aufgezeichnet. Ein komplettes Spektrum ist typischerweiseIn einer Sekunde erworben, obwohl eine höhere Zeitauflösung nach dem Signal-zu-Rausch-Niveau erreicht werden kann und eine quantitative Schätzung der VOC-Headspace-Konzentration auch ohne Kalibrierung 9 , 10 erfolgen kann .
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines PTR-MS. Schematische Darstellung des PTR-MS-Instruments HC: externe Ionenquelle mit Hohlkathode; SD: Quelldrift; VI, Venturi-Einlass; EM, Elektronenvervielfacher; FC1-2, Durchflussregler. Nachdruck mit Genehmigung von Boschetti et al. 7 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
11 . PTR ist von großem Interesse für die Umwelt-, Atmosphären-, Lebensmittel-, Technologie-, Medizin- und Biowissenschaften 12 .
VOCs, die mit Nahrungsmittelmatrizen assoziiert sind, sind von herausragendem Interesse an der Lebensmittelwissenschaft und -technologie wegen ihrer wichtigen Rolle in der molekularen Basis von biologischen Phänomenen, die mit Geruch und Geschmackswahrnehmung verbunden sind, und damit in der Nahrungsakzeptanz. Daher ist unser Interesse an Echtzeit und nicht-invasiven Erkennung von VOCs hauptsächlich mit sensorischen Qualitäten von Lebensmitteln beschäftigt. Wenn wir darüber hinaus die Möglichkeit betrachten, Verderb und pathogene Mikroorganismen mittels freigesetzter VOCs 13 zu detektieren und / oder flüchtige organische Verbindungen als Marker zu untersuchen,(Z. B. Maillard-Nebenprodukte bei thermischen Behandlungen) 14 wird deutlich, wie die VOC-Identifizierung und Quantifizierung für das Lebensmittelqualitätsmanagement von Interesse sind. Mehrere neuere Anwendungen von PTR-MS-Technologien zur schnellen Überwachung und Quantifizierung von VOCs in Lebensmittelmatrizen belegen das breite Anwendungsspektrum dieser analytischen Ansätze ( Tabelle 1 ).
| Lebensmittelmatrix | Art der Anwendung | Kurze Beschreibung | Referenz |
| Butter | Screening / Charakterisierung | Geographische Herkunft der europäischen Butters | 15 |
| Joghurt | Bioprozessüberwachung | Evolution bei Milchsäure fermentation | 16 |
| Müsliriegel | In-vivo- Messung | Nosespace während des Verbrauchs von Getreidestäben mit unterschiedlicher Zuckerzusammensetzung | 17 |
| Flüssigmodellsysteme | Simulierte orale Bedingungen | Auswertung von Zungen- und Mundverhältnissen in einem Modellmund | 18 |
| Apfel | In-vivo- Messung | Nosespace während des Verbrauchs Apfel mit verschiedenen genetischen, strukturellen und physikochemischen Parametern | 19 |
| Kaffee | Screening / Charakterisierung | Differenzierung von Kaffeespezialitäten | 20 |
| Traubenmost | Screening / Charakterisierung | Wirkung des Kochprozesses | 21 |
| Aromatisierte Süßigkeiten | In-vivo- Messung | Bestimmung auf Panelisten mit unterschiedlichenDirekte Massenspektrometrieverfahren | 22 |
| Schinken | Screening / Charakterisierung | Wirkung des Schweinezuchtsystems | 23 |
| Brot | Simulierte orale Bedingungen | Simulieren des Brotaromas bei der Mastikation | 24 |
| Milch | Screening / Charakterisierung | Überwachung von Photooxidations-induzierten dynamischen Veränderungen in der Milch | 25 |
| Kaffee | Screening / Charakterisierung | Vielfalt in gerösteten Kaffees aus verschiedenen geographischen Ursprüngen | 26 |
| Brot | Bioprozessüberwachung | Wirkung von verschiedenen Hefe-Startern während der alkoholischen Gärung | 27 |
| Kaffee | In-vivo- Messung | Nosespace beim Verzehr von verschiedenen gerösteten Kaffeevorbereitungen | 28 |
| Screening / Charakterisierung | Auswirkungen des Produktionsstandortes, des Produktionssystems und der Vielfalt | 29 | |
| Brot | Bioprozessüberwachung | Wirkung von Mehl, Hefe und deren Wechselwirkung während der alkoholischen Gärung | 30 |
| Pilze | Screening / Charakterisierung | Haltbarkeit von getrockneten Steinpilzen | 31 |
| Joghurt | Bioprozessüberwachung | Wirkung verschiedener Starterkulturen während der Milchsäurefermentation | 32 |
| Apfel | Screening / Charakterisierung | Vielfalt in einer Apfel-Keimplasmasammlung | 33 |
| Kaffee | Screening / Charakterisierung | Tracing Kaffee Herkunft | 34 |
| Kaffee | In-vivo- Messung | Kombination von aDynamische sensorische Methode und In-vivo-Nosespace-Analyse, um die Kaffee-Wahrnehmung zu verstehen | 35 |
Tabelle 1: Liste der wissenschaftlichen Studien mit PTR-ToF-MS im Lebensmittelbereich. Nicht erschöpfende Liste von wissenschaftlichen Studien mit PTR-basierten Ansätzen zur Überwachung des VOC-Gehalts in lebensmittelbezogenen Experimenten.
In neueren Studien berichteten wir über die Anwendung von PTR-ToF-MS mit einem automatisierten Probenahmesystem und maßgeschneiderten Datenanalyse-Tools, um die Probenahmeautomatisierung und -sicherheit zu erhöhen und damit das Potenzial dieser Technik 7 , 10 , 13 zu erhöhen. So konnten wir im Hinblick auf den VOC-Gehalt große Sample-Sets ( zB Lebensmittel unterschiedlicher Herkunft mit vielen Replikaten, ganze Keimbläschen) aufzeigen, um den Einfluss mehrerer experimenteller Modi auf die VOC-Freisetzung zu analysieren ( zB unterschiedliche Konzentrationen)Eines bestimmten Inhaltsstoffs, diverse Intensitäten eines spezifischen technologischen Parameters) und zur Überwachung von VOCs, die mit einem gegebenen Bioprozess assoziiert sind ( zB enzymatische Oxidation, alkoholische Fermentation). Um hier das Potenzial von PTR-ToF-MS im Agrar- und Ernährungssektor zu veranschaulichen, stellen wir drei paradigmatische Anwendungen vor: die Erkennung von VOCs, die während der Milchsäure-Fermentation von Joghurt, die durch verschiedene mikrobielle Starterkulturen induziert wird, freigesetzt werden (Online-Bioprozess-Monitoring ), Die Überwachung von VOCs, die mit verschiedenen Apfelsorten assoziiert sind (großformatiges Screening) und die in vivo- Untersuchung der retronasalen VOC-Freisetzung beim Trinken von Kaffee (Nosespace-Analyse).
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Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien unseres institutionellen Ausschusses für Humanforschung Ethik.
1. Probenvorbereitung und Autosampler-Bedingungen
- Online-Bioprozess-Monitoring: Erkennung von VOCs, die während der Milchsäure-Fermentation von Joghurt freigesetzt werden
ANMERKUNG: Dieser Abschnitt des Protokolls stellt einen Teil des von Benozzi et al. 32- Füge 5 ml pasteurisierte Milch zu jeder Durchstechflasche hinzu (20 ml Glasfläschchen mit PTFE / Silikon Septa). Beachten Sie die Art der verwendeten Milch und heizen Sie die Proben schnell auf 45 ° C. Übertragen Sie sie auf einen multifunktionalen GC-Autosampler mit einem temperaturgesteuerten Tablett (45 ° C).
- Benutzen Sie den Roboterarm des Autosamplers, um die Fläschchen mit den mikrobiellen Starterkulturen zu impfen (nach den Vorgaben des Starterkulturherstellers). Stellen Sie die Inkubationszeit entsprechend der Typologie des gewünschten Joghurts und der Spezifikation einS berichtet von Starter Kultur Hersteller. Setzen Sie den Autosampler, um eine Probe nach dem anderen bequem zu analysieren, um eine Online-VOC-Überwachung der Milchsäurefermentation während der Joghurtvorbereitung zu erhalten.
- Großes Screening: Überwachung von VOCs, die mit verschiedenen Apfelgenotypen assoziiert sind
ANMERKUNG: Dieser Abschnitt des Protokolls stellt einen Teil des von Farneti et al. 33 , 36- Probe Äpfel in der gewünschten Phase der Reifung / Konservierung ( zB im kommerziellen Ernte-Stadium). Wählen Sie mindestens fünf homogene Früchte ohne sichtbare Schäden für jeden Klon. Lagern Sie die Äpfel für den gewünschten Zeitraum bei Raumtemperatur (25 ° C) oder kühlen Sie (4 ° C).
- Sammeln Sie fünf zylindrische Scheiben (1,7 cm Durchmesser und 1 cm Dicke) von jedem Apfel mit einem Fleisch Klinge Probenehmer. Füge einen Teil des Kortexgewebes ein und vermeide den Kernteil mit Samen.Die Proben sofort homogenisieren und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren.
- Vor der Analyse legen Sie drei Replikate der 2,5 g Apfelprobe aus jedem biologischen Replikat in die Fläschchen (20 ml Glasfläschchen mit PTFE / Silikon Septa). Die Probe mit 2,5 ml entionisiertem Wasser, 1 g Natriumchlorid, 12,5 mg Ascorbinsäure und 12,5 mg Zitronensäure vermischen und die Proben bei 4 ° C bis zur Analyse (maximal 3 Tage) aufbewahren.
- Inkubieren Sie die Proben bei 40 ° C und stellen Sie dann den Autosampler ein, um die VOCs automatisch zu analysieren.
- Nosespace-Analyse: Studium der retronasalen Freisetzung von VOCs beim Kaffee trinken
ANMERKUNG: Dieser Abschnitt des Protokolls stellt einen Teil des von Romano et al. 28- Bereiten Sie Kaffee aus gemahlenen Kaffeeproben vor.
- Verwenden Sie eine Kaffeemaschine: melden Sie das Wasser / Pulver-Verhältnis, die Art des verwendeten Mineralwassers,Die Art der Kaffeemaschine und das Verfahren, um das Kaffeegetränk zu erhalten (Mengen sind eine Funktion der Dimension der Kaffeemaschine).
- Verwenden Sie eine 6-Tassen-Herd-Top-Kaffeemaschine, bekannt in Italien als "Moka", mit 450 ml Wasser und 30 g Kaffeepulver. Den gebrühten Kaffee in ein Gefäß geben und in ein Thermostatwasserbad (60 ° C) überführen.
- Für jeden Kaffee brauen 7,5 ml Aliquots zu einem Polystyrolbecher (40 ml) mit einer Plastikkappe. Haben Sie jeden Tafelgeschmack das Getränk nach dem Protokoll: i) 30 s freie Atmung, ii) ein einziger Schluck Kaffee, gefolgt von einem schnellen Schluck und iii) 3 min Atmung in ein ergonomisches Glas Nasenstück 28 .
- Wiederholen Sie das ganze Experiment für drei aufeinanderfolgende Tage, randomisieren die Reihenfolge der Kaffee Proben und Panelisten jeden Tag.
- Führen Sie die Probenahme durch, indem Sie ein einseitiges ergonomisches Nasenstück in Silikonkautschuk auf die Nase der Panelisten auftragen. Verbinden Sie die nDas PTR-ToF-MS mittels eines PEEK-Rohres, das nur im ersten Teil in Kontakt mit dem Plattenkörperkörper unbeheizt ist, wird dann bei 110 ° C in einem Einlassschlauch erwärmt, der die Probenahme-Schnittstelle mit dem PTR-MS verbindet Instrument.
HINWEIS: In Tabelle 2 wurde eine Liste von Produkten analysiert, die mit analogen Verfahren zu den von Benozzi et al. 32 , Farneti et al. 33 , 36 und Romano et al. 28 wird berichtet.
- Bereiten Sie Kaffee aus gemahlenen Kaffeeproben vor.
| Lebensmittelmatrix | Anzahl und Art der Proben | Referenz |
| Apfel | Die Autoren zeigten eine Sammlung von 190 Beitritten, die aus alten und neuen Apfelsorten zusammengesetzt waren | 33 |
| Joghurt | Vier Starter wurden in Form von VOCs analysiert, die während der Milchsäurefermentation von Joghurt freigesetzt wurden (A, FD-DVS YF-L812 Yo-Flex, Chr. Hansen, B, FD-DVS YC-380 Yo-Flex, Chr. Hansen, C, FD -DVS YC-X11 Yo-Flex, Chr. Hansen, D, YO-MIX 883, Danisco) | 32 |
| Kaffee | Drei verschiedene Art von gemahlenem Kaffee, der aus einer einzigen reinen Arabica-Kaffee-Mischung gewonnen wurde, wurden verwendet: mittlerer Braten, dunkler Braten und entkoffeinierter mittlerer Braten | 28 |
Tabelle 2: Liste der analysierten Produkte Liste der mit analogen Verfahren analysierten Produkte zu den von Benozzi et al. 32 , Farneti et al. 33 , 36 und Romano et al. 28
2. Experimentelles Design und praktische Vorsichtsmaßnahmen
- Führen Sie mindestens drei inter-day biologische ReplikTes, jeweils mit drei technischen Replikaten, für jeden experimentellen Modus.
- Vor der Probeninkubation und -analyse den Kopfraum mit sauberer Luft für 1 min bei 200 sccm für jede Durchstechflasche spülen.
- Bereiten Sie für jeden experimentellen Modus einen Rohling vor, inkubieren und analysieren Sie den Rohling unter den gleichen Bedingungen der Proben.
- Randomisieren Sie die Reihenfolge der Proben / Leerzeichen für die Analyse.
- Ähnlich wie bei anderen Methoden zur Erkennung von VOCs, beschränken Sie die Verwendung von parfümierten Körperpflegeprodukten sowie Gummi und Zigaretten, bevor Sie das Instrument verwenden. Die flüchtigen Chemikalien im Labor vollständig verschließen und bei der Prüfung so viel wie möglich kontrollieren.
3. PTR-MS Instrumentenoptimierung und -analyse
HINWEIS: Die instrumentellen Bedingungen sind in den Referenzen beschrieben ( zB Makhoul et al ., 27 ).
- Führen Sie Headspace-Messungen der Proben mit einem commerciAl PTR-ToF-MS Gerät im Standard-Konfigurationsmodus.
- Direkte Einspritzung der Luft in den PTR-MS Driftrohr Headspace ohne Behandlung. Es gibt einen kontinuierlichen Fluss von Probenluft durch die PTR-MS, so dass die Injektion durch einfaches Einführen des Endes des PTR-MS-Einlasses in den Probenkopfraum erreicht wird.
- Die folgenden Ionisationsbedingungen im Driftrohr kontrollieren und ständig überprüfen: 110 ° C Driftrohrtemperatur, 2,30 mbar Driftdruck, 550 V Driftspannung. Dies führt zu einem E / N-Verhältnis von etwa 140 Td (1 Td = 10 -17 cm 2 V - 1 s - 1 ). Die Einlassleitung besteht aus einem PEEK-Kapillarrohr (Innendurchmesser 0,04 in.), Das bei 110 ° C erwärmt wurde. Stellen Sie standardmäßig den Eingangsfluss auf 40 sccm ein.
- Stellen Sie die Abtastzeit pro Kanal der ToF-Erfassung auf 0,1 ns ein und belaufen sich auf 350.000 Kanäle für ein Massenspektrum von bis zu m / z = 400. Jedes einzelne Spektrum ist die Summe von etwa 28.600 Akquisitionen von 35Μs, was zu einer zeitlichen Auflösung von 1 s führt.
HINWEIS: Spectra werden dann kontinuierlich gespeichert. Spektrometrische Signale wachsen von einem Hintergrundniveau zu einem stabilen Wert in wenigen Sekunden (die Zeit, die benötigt wird, um das Gas in den Einlassleitungen zu ersetzen) und nur die nach diesem Übergang erworbenen Spektren werden in einer weiteren Analyse betrachtet.
4. Maßgeschneiderte Datenanalyse
HINWEIS: Die maßgeschneiderte Datenanalyse wurde mit einem Verfahren in MATLAB entwickelt.
- Korrigieren Sie die Zählverluste aufgrund der Ionendetektor-Totzeit über eine Methodik, die auf Poisson-Statistiken basiert, wie von Cappellin et al. 10
- Führen Sie die interne Kalibrierung nach einem von Cappellin et al. Um eine gute Massengenauigkeit (bis zu 0,001 Th) zu erreichen.
- Durchführen einer zusammengesetzten Annotation, die die erhaltenen Spektraldaten mit Fragmentierungsdaten von Referenzstandards und mit Daten r vergleichtIn der wissenschaftlichen Literatur eingegeben.
- Führen Rauschunterdrückung, Baseline-Entfernung und Peak-Intensität Extraktion nach Cappellin et al. 39 , mit modifizierten Gaußern, um die Gipfel passen.
- Berechnen Sie die Peakintensität in ppbv (Teile pro Milliarde Volumen) über die von Lindinger et al. 5 , unter Verwendung des geeigneten Reaktionsgeschwindigkeitskoeffizienten oder eines konstanten Wertes für den Reaktionsgeschwindigkeitskoeffizienten (k = 2,10 - 9 cm 3 s - 1 ), wenn die darunterliegende Verbindung nicht bekannt ist. Letzteres führt einen systematischen Fehler von bis zu 30% ein, der bei der Angabe des tatsächlichen Koeffizienten berücksichtigt werden kann.
- Mine die Daten durch die Durchführung von Principal Component Analysis, Analysis of Variance, Tukey's Post-Hoc-Test und andere statistische Test / Analyse Anpassung der bestehenden Pakete entwickelt mit R ( zB Cappellin et al.
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Representative Results
Das flüchtige Profil der Proben ergab ein vollständiges Massenspektrum für den gewünschten Massenbereich, der jede Sekunde erworben wurde. In Fig. 2 ist ein Beispiel für die erworbenen Durchschnittsspektren während des Joghurt-On-line-Bioprozesses gegeben 32 . In jedem Spektrum können mehr als 300 Massenspitzen im m / z Bereich bis zu 250 Th identifiziert werden 32 .
Abbildung 2: Durchschnittliche PTR-ToF-MS-Spektren einer Probe von inokulierter Milch während der Joghurtherstellung Niedriger Massenbereich der durchschnittlichen PTR-ToF-MS-Spektren einer Probe von inokulierter Milch während der Joghurtherstellung: Es wurden mehr als 300 Massenspitzen im m / z-Bereich bis zu 250 Th identifiziert. Nachdruck mit Genehmigung von Benozzi et al. 32Ove.com/files/ftp_upload/54075/54075fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In den folgenden Fällen berichten wir über Ergebnisse, die mit der vorgeschlagenen maßgeschneiderten Datenanalyse erhalten wurden, für die drei im Protokoll beschriebenen Anwendungen. Wir betonen, dass die gesamte Datenanalyse in ein oder wenigen Tagen durch maßgeschneiderte Software durchgeführt werden kann, die in unserem Labor 10 , 40 entwickelt wurde . In Abbildung 3 , in Bezug auf die VOC-Detektion während der Milchsäurefermentation von Joghurt (Online-Bioprozessüberwachung), zeigen wir eine unterschiedliche Fermentationskinetik von neun ausgewählten Massenspitzen, die vier verschiedenen kommerziellen Starterkulturen 32 entsprechen. Wenn der molekulare Peak gesättigt ist, wie bei Acetaldehyd in diesem Beispiel, kann das entsprechende 13 C-Isotopologe verwendet werden, um die Konzentration zu schätzenTration
Die meisten dieser flüchtigen Bestandteile zeigten eine klassische mikrobiell-ähnliche Kinetik mit einer anfänglichen Verzögerungsphase, gefolgt von einer Wachstumsphase und einer Post-Log-Phase 32 . Interessanterweise konnten wir mit der Online-Analyse erstmals eine bestimmte Verarmungskinetik für vier schwefelhaltige Verbindungen hervorheben ( zB Kinetik für Methanthiol, Abbildung 3e ).
Abbildung 3: Fermentationskinetik von neun ausgewählten Massenspitzen während der Joghurtfermentation mit vier verschiedenen Starterkulturen. Fermentationskinetik von neun ausgewählten Massenspitzen: ( a ) Acetaldehyd, ( b ) Diacetyl, ( c ) 2-Hydroxy-3-pentanon / Pentansäure, ( d ) Benzaldehyd, ( e ) metHanthiol, ( f ) Acetoin, ( g ) Butansäure, ( h ) 2-Butanon, ( i ) Heptansäure (Mittelwert von drei Replikaten ± Standardabweichung) (vorläufige Identifizierung). Offener Kreis (○), nicht geimpfte Milch; (▲), gefülltes Dreieck (▲) und gefüllte Rhombi (♦) entsprechen vier verschiedenen mikrobiellen Startern, die einzeln für die Joghurtfermentation verwendet wurden. Asterisks zeigen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, p <0,05) unter kommerziellen Startern. Nachdruck mit Genehmigung von Benozzi et al. 32 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In letzter Zeit haben wir VOCs erkannt, die mit einer großen Apfelsammlung verbunden sind, die durch 190 Accessio repräsentiert wirdNs (Beispiel für eine mögliche Anwendung für das großformatige Screening) 33 . Das horizontale Dendrogramm, das auf dem definierten VOC-Inventar basiert, das der Sammlung zugeordnet ist, hebt die Anwesenheit von sechs Hauptclustern hervor, die hauptsächlich von Estern und Alkoholen bestimmt werden (Abbildung 4 ). Diese Erkenntnisse führten uns dazu, einen Alkohol- / Ester-Index zu definieren und ihn als neuen Fruchtqualitätsdeskriptor vorzuschlagen, der als zusätzliche Charakterisierung von Äpfeln geeignet ist 33 .
Abbildung 4: Wärmekarte und zweidimensionale hierarchische Dendrogramme der VOC-Muster, die in 190 Apfelzugängen von PTR-ToF-MS bewertet wurden. Hitzekarte und zweidimensionale hierarchische Dendrogramme der VOC-Muster, die in 190 Apfelzugängen von PTR-ToF-MS (mit einer Schwelle von 25 ppbv) bewertet wurden. Apfel-Sorten sind gruppiert und gruppiert nach Zeilen, während VOCVerbindungen sind nach Spalten organisiert. Cultivar-Cluster werden durch die Zahlen 1 bis 6 definiert und Gruppen von Verbindungen werden durch die Buchstaben A bis D definiert. Nachdruck mit Genehmigung von Farneti et al. 33 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wir schließen diesen Abschnitt mit Ergebnissen, die die mögliche Anwendung von PTR-ToF-MS in der in vivo- Studie der retronasalen VOCs-Freisetzung (Nosespace-Analyse) belegen. Abbildung 5 (linke Seite) beschreibt die kumulativen Profile für fünf Kaffeetester, die durch radiale Plots dargestellt werden, eine für die sensorische Analyse typische grafische Lösung. In dieser Studie wurden mittelbrüchige, dunkle Braten und entkoffeinierte mittelbrüchige gemahlene Kaffeeproben aus einer einzigen reinen Arabica-Mischung vorbereitet und submFür fünf Teilnehmer. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein reproduzierbarer und relevanter Unterschiede zwischen den Panelisten, wie es für die Panelisten p1 und p2 in Abbildung 5 (rechte Seite) 28 offensichtlich ist.
Abbildung 5: Radiale Darstellungen, die Freigabeprofile für einen ausgewählten Parameter ( dh Bereich) und drei Kaffeesorten darstellen. Radiale Plots, die Freisetzungsprofile für einen ausgewählten Parameter ( dh Fläche) und drei Kaffeesorten (mittlerer Braten, dunkler Braten und entkoffeinierter mittlerer Braten aus einer einzigen reinen Arabica-Mischung) darstellen. Links: kumulative Profile für fünf Panelisten; Auf der rechten Seite: Einzelprofile für zwei ausgewählte Panelisten (nämlich p1 und p2). Die Werte wurden durch Division durch die jeweiligen Standardabweichungen skaliert. Die halbkreisförmigen Bands an Die äußeren ränder repräsentieren chemische klassen, basierend auf vorläufiger peakidentifikation. Kreise zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Kaffeesorten (ANOVA und Tukey's Test, p <0,05). Nachdruck mit Genehmigung von Romano et al. 28 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Beispiel für Fast-GC PTR-ToF-MS-Chromatogramme. Chromatogramme, die aus einem Rotwein (sechs Replikate) und vier ausgewählten Peaks erhalten wurden, die vorläufig den Estern zugeschrieben wurden. Nachdruck mit Genehmigung von Romano et al. 45Et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Protonentransfer-Reaktions-Massenspektrometrie (PTR-MS), gekoppelt an Flugzeit- (ToF-) Massenanalysatoren, stellen einen gültigen Kompromiss zwischen der Notwendigkeit der Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger organischer Verbindungen und der Notwendigkeit einer schnellen analytischen Profilierung dar. Die hohe Massenauflösung, die den ToF-Massenanalysator charakterisiert, gibt / liefert relevante Empfindlichkeits- und Massenspektren mit erheblichem Informationsgehalt. Darüber hinaus erhöht die Anwendung von PTR-ToF-MS mit einem Auto-Sampler und maßgeschneiderten Datenanalyse-Tools, die den Automatisierungsgrad erhöhen, die Möglichkeiten dieser Technik.
In den vielen forschungs- und technologischen Gebieten, in denen die flüchtige Compound-Erkennung von Bedeutung sein kann, benötigen Lebensmittelwissenschaften und -technologie insbesondere Empfindlichkeit, Hochauflösungs- und Direktanalyse. Auf der einen Seite basieren die Referenzmethoden für die VOC-Analyse auf der Gaschromatographie, die mehr Spezifität liefert, aber i istNtrinsisch langsamer und kann eine ähnliche Empfindlichkeit nur zum Preis von zusätzlichen Vorbehandlungs- oder Konzentrationsverfahren erreichen. Eine schnelle Analyse, wie der Nasenraum, kann nicht mit GC-basierten Methoden durchgeführt werden. Andere Studien mit vielen PTR-MS und GC als komplementäre Ansätze: PTR_MS erlaubt die Messung von sehr großen Sample-Sets, während die GC-Analyse von reduzierten Teilmengen zusätzliche Informationen für eine bessere Interpretation der PTR-MS-Daten liefert 40 . Auf der anderen Seite wurden für die VOC-Analyse weitere schnelle Ansätze vorgeschlagen, zB solche, die auf E-Nasen oder MS-e-Nasen oder spezifischen Sensoren basieren. Diese sind im Vergleich zu PTR-MS viel kostengünstiger, bieten aber im Allgemeinen eine sehr geringe Empfindlichkeit.
Die PTR-ToF-MS-Analyse liefert Informationen über die Masse der beobachteten spektrometrischen Peaks, die im Allgemeinen für eine eindeutige Compound-Identifizierung nicht ausreichen. Darüber hinaus, trotz der weichen chemischen Ionisation, Proton trAnsfer induzierte Fragmentierung ist nicht immer vernachlässigbar. In einigen Fällen kann das Fragmentierungsmuster bei der vorläufigen Identifizierung hilfreich sein. Dennoch besteht die Notwendigkeit für technologische Lösungen, die die analytische Leistungsfähigkeit von PTR-ToF-MS verbessern. In diesem Punkt wird eine interessante Entwicklung der Technik durch die Verwendung von primären Elternionen außer H & sub3 ; O & spplus ; dargestellt. Das schaltbare Reagenz-Ionensystem (SRI) 4 kann alternativ in der gleichen Hohlkathodenquelle verschiedene Elternionen, wie NO + und O 2 +, erzeugen. Dieser Ansatz, der die Ionisationsbedingungen und damit die Fragment- und Clusterbildung verändert, erhöht die Anzahl der nachweisbaren Verbindungen und ermöglicht die Trennung einiger isomerer Verbindungen 42 , 43 . Ein paar Anwendungen in der Lebensmittelwissenschaft und -technologie sind bereits vorhanden, wie VOC detErminnung in trockengehärtetem Schinken 23 , Kaffee 34 und Ethylenbestimmung in Früchten 43 . Eine weitere technologische Lösung, die geeignet ist, um Schwierigkeiten bei der genauen Compound-Identifizierung zu bewältigen, wird durch die Fast-GC / PTR-ToF-MS-Methodik 44 dargestellt. Aufgrund der reduzierten Trennzeiten erweitert schnell-GC analytische Fähigkeiten, ohne den analytischen Durchsatz von PTR-ToF-MS 44 zu beeinträchtigen. Der Mehrwert der Technik ist in Fig. 6 gut dargestellt, was Chromatogramme zeigt, die für vier Peaks erhalten wurden, die vorläufig als Esterfragmente aus dem Kopfraum eines Rotweins 45 identifiziert wurden. Neben der wichtigen Trennung von verschiedenen isomeren Fragmenten innerhalb des gleichen Peaks wurde eine interessante erwünschte Nebenwirkung der Anwendung eines schnellen chromatographischen Trennschrittes durch die schnelle Elution (und damit eine wesentliche Eliminierung)N) Ethanol. In der Tat provoziert Ethanol eine unerwünschte Wirkung in der PTR-basierten Analyse von alkoholischen Matrizen aufgrund der Reduktion von Hydroniumionen und der daraus folgenden Bildung von Dimeren und Trimeren (Ethanolcluster, Ethanol- und Wassercluster und entsprechende Fragmente), was zur Gegenwart führt Von Peaks, die die korrekte Spektraldarstellung wesentlich beeinträchtigten 46 . In jüngster Zeit wurden weitere Entwicklungen vorgeschlagen, um die Empfindlichkeit von PTR-MS-Apparaten zu verbessern, die in der Lebensmittelwissenschaft und -technologie noch nicht getestet wurden 47 , 48 .
Abschließend bietet eine schnelle und nicht-invasive PTR-ToF-MS-Analyse von flüchtigen Verbindungen, gepaart mit automatischer Probenahme und maßgeschneiderten Datenhandhabung und -analyse, ein neues Werkzeug, das es ermöglicht, mehrere Themen in der Lebensmittelwissenschaft und -technologie effizient zu adressieren und die Ergebnisse anderer Techniken zu ergänzen .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MS | Ionicon Analytik Ges.m.b.H. | PTR-TOF 8000 | An detector for volatile organic compounds (VOCs) that allows for continuous VOC quantification with a very high mass resolution |
| GERSTEL MPS 2XL | Gerstel | A multifunctional autosampler | |
| Gas Calibration Unit | Ionicon Analytik Ges.m.b.H. | GCU-s / GCU-a | A dynamic gas dilution system that provides variable but known quantities of different standard compounds in a carrier gas stream |
| TofDaq | Tofwerk AG | free available at http://soft.tofwerk.com/ | A data acquisition software (for spectra acquisition) |
| MATLAB | MathWorks | http://it.mathworks.com/products/matlab/ | A technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, and data analysis |
| R | The R Foundation | free available at https://cran.r-project.org/mirrors.html | A language and environment for statistical computing and graphics |
References
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- Berchtold, C., Bosilkovska, M., Daali, Y., Walder, B., Zenobi, R. Real-time monitoring of exhaled drugs by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 33 (5), 394-413 (2014).
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