유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA 서열 (RNAseq)는 유전자 발현 돌연변이 유전자 융합체, 및 비 암호화 RNA를 검출하고 특성화하는 데에 이용 될 수있는 다목적 방법이다. 1 억 순서 읽고 등의 mRNA 및 비 암호화 RNA를 여러 RNA 제품을 포함 할 수있다 - 표준 RNAseq (30)가 필요합니다. 우리는 타겟 RNAseq (캡처) 바탕 화면 시퀀서를 사용하여 선택 RNA 제품에 초점을 맞춘 연구를 허용하는 방법을 보여줍니다. RNAseq 캡처 그렇지 않으면 기존의 RNAseq 방법을 사용하여 놓칠 수있다, 주석이 달려 있지 않은 저, 또는 일시적으로 표현 된 성적 증명서를 특성화 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 세포 라인, 리보솜 RNA 고갈, cDNA 합성, 바코드 라이브러리, 바탕 화면 시퀀서에 하이브리드 및 목표 성적 증명서의 캡처 및 다중 서열의 준비에서 RNA의 추출을 설명합니다. 또한 품질 관리 평가, 정렬 검출 융합 유전자 발현의 정량화 및 단일 NUC의 식별을 포함하는 연산 파이프 라인을 분석, 개요leotide 변형. 이 분석은 유전자 발현, 유전자 융합, 돌연변이의 특성을 타겟팅 사체 서열을 허용한다.
서론
전체 전사체 또는 RNA 염기서열분석(RNAseq)은 모든 RNA 산물을 평가하기 위한 편향되지 않은 염기서열분석 방법입니다. targeted RNAseq(Capture)의 목표는 표준 RNAseq에 비해 감도 증가, 동적 범위 증가, 비용 또는 규모 감소, 처리량 증가를 통해 선택된 전사체를 집중적으로 평가하는 것입니다. 표준 RNAseq와 유사하게, 표적 농축 접근법은 유전자 발현, mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, 기타 비암호화 RNA2, 유전자 융합3 및 돌연변이4-6과 같은 여러 RNA 종을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Capture는 상보적인 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 포함하여 염기서열분석을 위한 cDNA 라이브러리를 풍부하게 합니다. RNAseq Capture의 근거는 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 프로브를 샘플에 하이브리드화한 다음 상대적 존재량을 측정하는 마이크로어레이 접근법과 유사합니다. 마이크로어레이 기술의 경우, 발현은 이러한 프로브에 결합하는 전사체에 대해 측정된 상대 신호를 기반으로 합니다. 따라서 마이크로어레이는 범위, 비특이적 결합으로 인한 잠재적인 배경 잡음 및 프로브의 교차 혼성화에 의해 제한됩니다. ....
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프로토콜
참고 :이 프로토콜은 동시 처리 및 4 개의 샘플의 분석을 설명합니다. 이 방법은 세포에서 분리 된 RNA, 냉동 조직과 포르말린 고정 파라핀 조직 (FFPE)와 호환됩니다. 각 샘플에 대해 RNA 입력을 시작하는 1000 NG (250 권장 NG) -이 프로토콜은 50로 시작합니다.
1. rRNA의 고갈 및 RNA 절차의 분열
- rRNA의 고갈
- 실온에서 -20 ° C와 해동에서 용출, 프라임, 조각 믹스, rRNA의 제거 믹스, rRNA의 결합 버퍼와 부유 버퍼를 제거합니다. 4 ° C에서 용출 버퍼, rRNA의 제거 구슬과 RNA / cDNA를 특정 상자성 비드를 제거하고 실내 온도에 가져.
- PCR 튜브에 RNA의 0.25 μg의 추가. 10 μl의 총 최종 부피 클레아없는 초순수 총 RNA를 희석한다. 각 튜브에 rRNA의 결합 버퍼의 5 μl를 추가하면 부드럽게 pipett 5 rRNA의 제거 믹스의 μL 및 추가전자 위아래로 혼합합니다. 뚜껑을 열 자전거 타는 사람에 장소 튜브는 RNA를 변성 5 분 동안 68 ° C에 100 ° C 및 프로그램 열 자전거 타는 사람에 미리 가열.
- RNA 변성 후, 열 순환기에서 관을 제거하고 1 ....
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결과
RNAseq 캡처 개략적 강조 주요 단계가도 1에 도시되어있다. 공지 된 돌연변이와 함께 4 개의 암 세포주는 RNAseq 캡처 기술의 유효성을 증명 하였다 (K562 ABL1 융합, RET 융합과 LC2와, EOL1 PDGFRalpha 융합 및 RT-으로 4 FGFR3 융합과). 네 개의 샘플을 함께 모으고 100 혈압 FASTQ 파일을 생성하는 데스크탑 시퀀서에 판독 2 배속으로 서열화 하였다. 인간 사체 1) 품질 관리 평가 2) 정렬 3) 유전자 발현의 정량 분석, 4) 융합 호출 및 5) 변형 호출 : FASTQ 파일 다섯 가지 주요 구성 요소를 포함하는 RNAseq 분석 파이프 라인을 통해 실행 하였다. 정렬 파일 (BAM)은 단일 염기 변이를 호출 유전자 발현을 계산하는데 사용된다. 융합은 (자신의 정렬 수행) 등 TopHat 융합 등 융합 발신자를 사용하여 .......
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토론
RNAseq 캡처 RNAseq 및 마이크로 어레이 사이의 중간 전략은 사체의 선택된 부분을 평가하기위한 접근이다. 캡처의 이점은 유전자 변형의 데스크탑 시퀀서, 높은 처리량, 및 검출에 선정 신속한 처리 시간 감소를 포함한다. 이 방법은, 비 코딩 RNA를 (23)의 특성을 단일 염기를 검출하도록 구성 될 수있는 RNA의 스 플라이 싱을 조사하고 유전자 융합체 또는 구조적 재 배열 (24)을 식별하기 위해, 4-6 변종. 또한,이 방법은 파라핀 블록 (24, 25)에 포르말린으로 고정 후의 임베디드 한 임상 샘플 또는 처리에 적용될 수있다.
마이크로 어레이에 비해 RNAseq 캡처 몇 가지 중요한 이점이 있으며, 실시간 정량 PCR, 생거 시퀀싱 및 DNA 시퀀싱. 마이크로 어레이 인해 크로스 하이브리드 및 프로브의 결합이 아닌 특정 높은 배경에 의해 제한된다. 리터와 유전자의 정량고도로 발현 유전.......
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공개 사항
S.R.은 임상 시험 수행을 위해 Novartis 및 Ariad Pharmaceuticals로부터 자금을 지원합니다. SR 직계 가족은 Johnson and Johnson의 주식을 소유하고 있습니다.
감사의 글
기술 지원을 해주신 Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto, Eric Samorodnitsky에게 특별한 감사를 드립니다. 또한 우리 팀에 대한 행정적 지원을 해주신 Jenny Badillo에게도 감사드립니다. 오하이오 슈퍼컴퓨터 센터(Ohio Supercomputer Center, OSC)가 디스크 공간, 처리 용량 및 분석 실행을 위한 지원을 제공해 준 것에 대해 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업에 대한 행정적 지원에 대해 오하이오 주립대학교 웩스너 메디컬 센터(Ohio State University Wexner Medical Center)의 종합 암 센터(CCC)에 감사드립니다. S.R.과 팀은 미국 암 학회(American Cancer Society, MRSG-12-194-01-TBG), 전립선암 재단(Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award), NHGRI(NHGRI, UM1HG006508-01A1), 포어 암 연구 재단(Fore Cancer Research Foundation), 미국 폐 협회(American Lung Association) 및 펠로토니아(Pelotonia)의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| 분자 생물학 등급 에탄올 | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq 시약 키트 v2 (300- 주기) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq 데스크탑 시퀀서 | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMP레그; XP - PCR 정제 비즈 | Beckman-Coulter | A63880 | |
| 다이나비드® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT 인간 DNA, 형광 측정 등급, 1 mg | Roche 응용 과학 | 05480647001 | |
| Qubit® 분석 튜브 | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS 분석 키트 | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ 하이브리드화 및 세척 키트 (24 또는 96 반응) | 로슈 님블젠 | 05634261001 또는 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 형광측정기 | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ 96&ndash의 열 순환기; Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ 혼성화 및 세척 키트, | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II, Reverse Transcription 200 U/μ l | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA 스크린 테이프 사다리 | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape 샘플 버퍼 | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| 수산화나트륨 | 시그마 | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| 클로로포름 | 시그마 | C2432-1L | |
| KAPA 핫스타트 레디믹스 | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 분광 광도계 | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 시약 | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
참고문헌
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014....
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