Stripe Assay per studiare l'attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell'ippocampo
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
Guida Axon è il processo attraverso il quale i neuroni appena formati inviano assoni al loro obiettivo durante lo sviluppo del sistema nervoso 1,2. assoni in via di sviluppo portano una struttura altamente mobili al loro punta chiamato il cono di crescita. Il cono di crescita rileva segnali extracellulari per navigare il percorso del assone. Molecole di guida, come ad esempio a fessura, semaphorin, e efrine, possono attrarre o respingere gli assoni a seconda della loro interazione con i recettori idonei e co-recettori presenti sulla assone 1,3,4. I recettori attivati trasferire segnali al cono di crescita che riguardano l'organizzazione del citoscheletro per i movimenti degli assoni e la crescita-cono.
Vari metodi sono stati sviluppati per valutare l'azione di molecole attrattivi e repellenti. Chemio-attrattivi e repellenti possono essere somministrati nel mezzo di crescita / cultura con un gradiente di concentrazione (ad es., Camera di Dunn o μ-slides) 5,6, in una zona ad alta concentrazione da micro-pipette (ad es., test di tornitura) 7 o ad una concentrazione omogenea applicazione da bagno (ad es., test di caduta cono di crescita) 8,9.
Altri metodi includono un saggio banda o stampa microcontact (μCP), in cui un chemio-attrattivo o repellente è rivestito sulla superficie di una piastra come substrato 10-12. Thestripe saggio è stato originariamente sviluppato da Bonhoeffer e colleghi nel 1987 per analizzare la mappatura topografica del pulcino sistema di retino-tectal 13. Il metodo originale ha richiesto un sistema di vuoto a proteine di rivestimento su membrane Nucleopore policarbonato utilizzando righe e matrici maglie. Nelle versioni successive, le proteine ricombinanti sono stati stampati direttamente sulla superficie di una piastra di coltura in un modello a strisce utilizzando matrici di silicio stretta fessura 14,15. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno applicato con successo questo test striscia per l'analisi delle attività di orientamento degli assoni molecola 16-21.
<p class = "jove_content"> Qui, vi presentiamo il protocollo dettagliato per un test che misura la striscia di attrazione o repulsione di molecole di guida degli assoni di neuroni dell'ippocampo dissociati. In particolare, questo metodo può essere applicato in laboratorio minimamente attrezzate. Per questo test, alternando strisce di un substrato fluorescente e una proteina di controllo sono generati su un piatto di plastica utilizzando una matrice di silicio con feritoie 90 micron e rivestiti con laminina. Nella nostra dimostrazione, dissociato neuroni dell'ippocampo dei topi E15.5 sono state coltivate su strisce di ectodomain ricombinante di fibronectina e proteine transmembrana-2 (FLRT2) ricchi di leucina e controllare Fc proteine 21 alternata. Dopo 24 ore di cultura, sia gli assoni e corpi cellulari dei neuroni sono stati fortemente respinti dalle strisce FLRT2. Colorazione con un anticorpo anti-Tau1 rivelato che ~ 90% dei neuroni sono stati distribuiti sulle regioni Fc rivestite, rispetto a ~ 10% sul FLRT2-Fc, indicando che FLRT2 ha una forte repulsivaFunzione per i neuroni dell'ippocampo 21.Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un test che utilizza la banda proteina ricombinante e neuroni dissociato dal ippocampo E15.5 mouse. Questo test permette l'osservazione efficiente delle risposte repulsive, attraenti, o neutri di neuroni ad una proteina ricombinante di interesse collocato in un motivo a righe. Un importante vantaggio di questo protocollo è il metodo semplice per generare le strisce, in cui la proteina è stampato direttamente sulla superficie di un piatto di plastica, rispetto al metodo tradizionale che r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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