Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Аксонов это процесс , с помощью которого вновь образованные нейроны посылают аксоны к своей цели при разработке системы 1,2 нервной. Развивающиеся аксоны несут в себе высокую двигательная структуру на их кончике называется конус роста. Конус роста ощущает внеклеточные сигналы для навигации путь аксона в. Молекулы Наведение, такие как щели, Semaphorin и Ephrins, могут привлекать или отталкивать аксоны в зависимости от их взаимодействия с соответствующими рецепторами и корецепторами на аксона 1,3,4. Активированные рецепторы передачи сигналов к конусу роста, которые влияют на его организации цитоскелета для аксонов и ростового конуса движений.
Различные методы были разработаны, чтобы оценить действие аттрактанта и репеллента молекул. Химио-аттрактанты и репелленты могут быть введены в рост / культуральной среды с градиентом концентрации (например., Камера Данна или х-горок) 5,6, в сильно концентрированном месте с помощью микро-рipette (например., поворачиваясь анализ) 7 или в гомогенной концентрации путем применения ванны (например., коллапс анализа конус роста) 8,9.
Другие методы включают в тест – полосках или микроконтактной печати (μCP), в котором химио-аттрактант или репеллент наносят на поверхность пластины в качестве подложки 10-12. Thestripe анализ был первоначально разработан Бонхёффера и коллегами в 1987 году для анализа топографического картирования в системе куриных ретино-tectal 13. Оригинальный метод требует вакуумной системы для белков оболочки на поликарбонатных нуклеопорные мембран с использованием полосатых и сложных топологий матриц. В более поздних версиях, рекомбинантные белки были непосредственно напечатаны на поверхности пластины культуры в полосатый узор с использованием узкой щели матрицы кремниевых 14,15. В последнее время различные исследовательские группы успешно применили эту полоса анализа к анализу деятельности молекулы аксонов 16-21.
<p claсс = "jove_content"> Здесь мы представляем подробный протокол для анализа полосы, который измеряет притяжение или отталкивание молекул аксонов для диссоциированных нейронов гиппокампа. Следует отметить, что этот метод может быть применен в минимально оборудованных лабораторных условиях. Для этого теста, чередуя полоски флуоресцентно меченого субстрата и контрольного белка генерируются на пластиковой чашке с использованием кремниевой матрицы с 90-мкм щели и покрывают ламинина. В нашей демонстрации, диссоциированных нейронов гиппокампа мышей E15.5 культивировали на чередующиеся полосы рекомбинантного эктодомена фибронектина и лейцин-богатый трансмембранный белок-2 (FLRT2) и управления Fc белка 21. Через 24 ч культуры, как аксоны и клеточные тела нейронов были сильно отталкивается от FLRT2 полос. Окрашивание с антителом анти-TAU1 показали, что ~ 90% нейронов были распределены по регионам с Fc-покрытием, по сравнению с ~ 10% на FLRT2-Fc, что указывает, что FLRT2 имеет сильное отталкивающеефункция для нейронов гиппокампа 21.Этот протокол описывает тест-полосках, который использует рекомбинантный белок и разложенных нейроны из гиппокампа E15.5 мыши. Этот анализ позволяет эффективно наблюдать отталкивающих, привлекательных, или нейтральных ответов нейронов к рекомбинантного белка, представляющего интерес…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
PBS | Nacalai | 14249-24 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |