Abstract
In reconstructieve chirurgie, is een klinische behoefte aan een alternatief voor de huidige methoden van autologe reconstructie die ingewikkeld en duur en handel een defect voor een ander zijn. Tissue engineering houdt de belofte om deze toenemende vraag te pakken. Echter, de meeste tissue engineering strategieën falen om een stabiele en functionele weefsel vervangers vanwege de slechte vascularisatie te genereren. Dit artikel richt zich op een in vivo tissue engineering kamer model van de intrinsieke vascularisatie waarbij een perfusie slagader en een ader ofwel als een arterioveneuze lus of een flow-through uitloper configuratie is gericht in een beschermde holle kamer. In deze kamer-gebaseerde systeem optreedt angiogene ontspruit uit de arterioveneuze schepen en dit systeem trekt ischemische en inflammatoire gedreven endogeen celmigratie die geleidelijk vult de kamer ruimte met fibro-vasculair weefsel. Exogene cel / matrix implantatie ten tijde van de kamer bouw verbetert cel survival en bepaalt specificiteit van de gemanipuleerde weefsels die zich ontwikkelen. Onze studies hebben aangetoond dat deze kamer model succesvol genereren verschillende weefsels zoals vet, hartspier, lever en anderen. Echter, modificaties en verfijningen moeten doelweefsel vorming consistent en reproduceerbaar te waarborgen. Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de productie van twee verschillende gevasculariseerde weefselmanipulatie kamermodellen in vivo.
Introduction
Vervaardigen van functionele doorbloed weefsel met behulp van een tissue engineering aanpak is een opkomende paradigma in de regeneratieve geneeskunde. 1,2 Veel benaderingen van nieuwe en gezond weefsel ingenieur voor de vervanging van beschadigd weefsel of defecte organen zijn ontwikkeld, 3-6 experimenteel in kleine dierlijke modellen met veelbelovende klinische potentieel. 7,8 Toch vascularisatie blijft een van de grote uitdagingen voor de tissue engineering beperken van de mogelijkheden om weefsels van klinisch relevante omvang groeien. 9
De huidige aanpak om weefsel vascularizeren volgen ofwel een extrinsieke route waar nieuwe schepen groeien vanuit de ontvanger vasculaire bed en binnen te dringen in de hele geïmplanteerde weefsel construeert 10 of een intrinsieke vascularisatie route, waar het vaatstelsel groeit en breidt uit in harmonie met de nieuw te ontwikkelen weefsel. 11 De extrinsieke benadering traditioneel omvat zaaien cellen op een steigerin vitro en implanteren van de volledige construct in het levende dier met de verwachting dat voedingsstoffen, eerder door kweekmedia geleverd, wordt aangeleverd door circulatie. 12,13 Het concept is simpel vasculaire ingroei te langzaam en slechts zeer dunne implantaten (< 1-2 mm dik) zal levensvatbaar blijven. Verschaffen van voedingsstoffen en zuurstof door middel van een voldoende snelle en vascularisatie is de kern van elke succesvolle pogingen om complexere en grotere weefselengineering substituten zoals bot, spier, vet en vaste organen groeien. 14,15 Intrinsieke vascularisatie sector stelt grotere constructies te ontwikkelen door progressieve groei van weefsel in verhouding met zijn uitbreiden bloedtoevoer. Een ontwerp is de in vivo implantatie in een kamer van een vaatsteel met of zonder cellen geënte scaffold. 5,6 Dit heeft de weg naar nieuwe procedures voor het genereren van dikkere intrinsiek gevasculariseerde weefsels vrijgemaakt. 16,17 </ P>
Recenter hebben strategieën ontwikkeld om vooraf vasculariseren weefseltransplantaten, vóór implantatie. Deze opgenomen bloedvat netwerken zijn erop gericht om te doen vergroeien met de ontvangende schepen op implantatie waardoor de snelle levering van een compleet bloedtoevoer naar de overleving van alle onderdelen van een getransplanteerd dikke weefsel graft te verbeteren. 18
We zijn voorlopers een in vivo doorbloed tissue engineering model in kleine dieren die een subcutaan geïmplanteerd halfharde omsloten ruimte met daarin een perfusie vaatsteel en-cel met biomaterialen gaat. De kamer creëert een ischemische omgeving die angiogene ontspruit uit de geïmplanteerde vaten stimuleert. 3 De vaatsteel kan ofwel een gereconstrueerd arterioveneuze lus of een intacte doorstroming slagader en ader zijn. 3-6,19 Deze vaatsteel spruiten een goed functionerende en uitgebreide arterio -capillary-veneuze netwerk dat verbindt aan beide arteriole en veneuze eindigt met de vaatsteel. 3,20 Bovendien, de omliggende holle hulpkamer beschermt de ontwikkeling van weefsel van potentieel vervormen mechanische krachten en verlengt de ischemische drive om vascularisatie te verbeteren. 3,21,22 Als het schip uitloper eenvoudig in is geïmplanteerd normaal weefsel en niet in de beschermde ruimte van de kamer, angiogenese houdt langs dezelfde tijdlijn als een normale wond en geen nieuw weefsel ophopen rond de pedikel. Onderzoekers hebben deze in vivo configuratie gebruikt om driedimensionale functionele gevasculariseerde weefselconstructen met ondersteunende vasculatuur en klinisch relevante afmetingen produceren. 4,23 Voorts gevasculariseerde de gemanipuleerde weefselconstructen met intacte vaatsteel kunnen worden geoogst voor latere transplantatie in de beschadigde plaats . 24,25 Een klinisch haalbaar scenario zou zijn het creëren van de kamer bij de definitieve locatie voor de wederopbouw such de borst. Aldus zou het de novo tissue engineering aanpak klinische potentie om een nieuwe bron van functionele doelweefsel voor reconstructieve chirurgie hebben. 26-28
Het volgende protocol wordt een algemene handleiding een in vivo gevasculariseerde weefselmanipulatie kamer construct in de rat, die kunnen worden aangepast in verschillende diermodellen en toegepast om de complexe processen van angiogenese, matrixproductie, en cellulaire migratie en differentiatie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van St. Vincent's Hospital in Melbourne, Australië, en werden uitgevoerd onder strikte naleving van de Australian richtsnoeren van de Raad National Health en Medical Research.
OPMERKING: tweekamer protocollen worden hieronder beschreven. De twee verschillende modellen en hun specifieke kamer ontwerpen zijn aangegeven in figuur 1. Kamer (1) is gemaakt van polycarbonaat (voor rat arterioveneuze lus kamermodel). Het is cilindrisch met een inwendige diameter van 13 mm en 4 mm. Een venster op een punt in de muur maakt onbelemmerde toegang voor de pedikel. In het tweede model (voor de rat doorstroming pedikel kamer model), wordt de kamer gemaakt van polyacryl en is rechthoekig (10 x 8 x 4 mm 3 inwendige afmetingen). Het heeft twee openingen 1,5 mm aan weerszijden aan de femorale slagader en ader geschikt aangezien zij de kamer overtreden.
1. Rat Arterioveneuze Loop Chamber Model (One Chamber per dier)
NB: Voorafgaand aan het starten van de operatie, zorg ervoor dat alle instrumenten naar behoren zijn gesteriliseerd. Ook zorgen voor de instrumenten rust op steriele handdoeken en op een redelijke afstand van het chirurgische veld om besmetting tijdens de procedure te voorkomen.
- Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
- Gebruik ratten met een gewicht van ten minste 250 gram voor hun grote omvang van de schepen voor de oprichting van de arterioveneuze lus.
- Verdoven het dier met 4% isofluraan inhalatie. Bevestigen voldoende diepte van de anesthesie door het beoordelen van ongevoeligheid tot teen-snuifje. Na verdoving, houdt het dier voldoende verdoofd gedurende de procedure met 2% isofluraan.
- Plaats het dier in liggende positie op een verwarmingskussen en steriel smeermiddel op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de operatie.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheren beide liezen en verwijder haar met een stuk vochtig gaas.
- Prep de chirurgische sites met chloorhexidine/ 70% ethanoloplossing en draperen het dier met steriele handdoeken. Dien één dosis Carprofen (5 mg / kg, subcutaan) als analgeticum.
- Harvest of lies Graft
- Met behulp van een # 15 blad, maak een 4 cm lange incisie aan de linker lies parallel aan het inguinale ligament. Dit onthult de lies vet pad.
- Snijd door de vet pad langs de omtrek met een schaar maar laat ze op haar vaatsteel op basis van de epigastrische vaten.
- Met behulp van micro-schaar, vrij de wazige bindweefsel verklevingen tussen de buikwand en de onderliggende femorale schepen.
- Plaats een oprolmechanisme aan de buikwand en trek mediaal. Dit onthult de inguinale ligament en de gehele lengte van de femorale vaten.
- Met behulp van micro tang en gebogen schaar ontleden de epigastrische ader en te isoleren uit de omliggende vet door het zachtjes te trekken en snijden. Deze geest werkt als een tuier de geconstrueerde lus.
- usinG Micro pincet en gebogen micro schaar open de perivasculaire omhulsel met daarin de femorale schepen en zenuwen helemaal uit de lies ligament om zijn bifurcatie distaal van de epigastrische tak.
- Met behulp van micro-tang, pak de lies door zijn adventitia en voorzichtig scheiden van de omliggende weefsels en bijbehorende slagader. Doe dit met micro pincet en gebogen ronde wees micro schaar door het weefsel uit elkaar te trekken en te snijden doorheen.
OPMERKING: grijp nooit de gehele dikte van de aderwand als dit trauma zou kunnen veroorzaken aan de intima waardoor het gevoelig voor trombose. - Ligeer zijtakken gevonden tijdens de dissectie met 10/0 nylon hechtdraad of stollen ze met een bipolaire coagulator.
- De femorale ader volledig vrij, ligeren zijn proximale en distale uiteinden met 4/0 zijden hechtdraden. Zorg ervoor dat een veneuze graft lengte ten minste 10 mm te verkrijgen en omvatten ongeveer 0,5 cm lengte van de epigastrische tak te gebruiken als scheerlijn kettingom de lus geopend in de kamer te houden.
- Met behulp van micro tang en rechte micro schaar, knip de adventitia van de uiteinden van het transplantaat door zachtjes te trekken en snijden. Dit kan ook later worden gedaan, voordat microchirurgische anastomosen.
- Spoel de ader graft met gehepariniseerde zoutoplossing (10 U / ml heparine) en laat het rusten in de oplossing. Sluit de wond met behulp van continu draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee of drie extra eenvoudige onderbroken steken.
- Creatie van Arterioveneuze Loop en Implantatie van Chamber
- Herhaal de stappen 1.2.1 tot en met 1.2.4 in de exact dezelfde manier op het contralaterale ledemaat.
- Met behulp van micro-tang, ontleden en te isoleren zowel de epigastrische slagader en ader van de omliggende vet pad te vormen. Doe dit door zachtjes te trekken van het weefsel uit de buurt van de vaten
- Met behulp van micro-tang, pak de dij slagader door zijn adventitia en vrij uit de omliggende weefsels. Doe dit met micro pincet en gebogen round-puntige micro schaar door het weefsel elkaar te trekken en snijden doorheen. Afbinden of coaguleren haar zijtakken.
- Afbinden de femorale slagader en ader distale tot de opkomst van de epigastrische vaartuigen die 4/0 zijden hechtdraad.
- Plaats één klem proximaal op elk van de femorale slagader en ader. Met behulp van een scherpe rechte micro schaar, maken een schone dwarsrichting in elk vat distale gesneden om de opkomst van de epigastrische takken. Plaats een steriele plastic contrast achtergrond onder de schepen.
- Spoel de schepen hevig met royale hoeveelheden gehepariniseerde zoutoplossing totdat al het bloed uit het lumen wordt verwijderd.
- Breng de ader graft in het operatiegebied en verwijder alle overbodige adventitia van de uiteinden van de schepen ', zoals per stap 1.2.10, indien nodig.
- Voer beide microchirurgische anastomosen met 10/0 nylon hechtdraad. Anastomose het proximale uiteinde van de bypass aan de femorale ader en het distale uiteinde op de femorale slagader. Hierdoor kan het bloed te laten stromen fROM De arteriële de veneuze kant zonder verzet van de kleppen in de ader graft.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de femorale schepen en de ader graft rust in hun natuurlijke houding, zonder enige wendingen. - Controleer op lekkage bij beide anastomotische sites. Resolve kleine lekken, die er uitzien als niet-pulserende bloed uit de anastomose site, door het plaatsen van een klein stukje vet op de top en voorzichtig te comprimeren voor 5-10 min. Grotere pulserende lekken die het hele veld snel overspoelen zal extra hechtingen nodig.
- Controleer doorgankelijkheid van de arterioveneuze lus. Gentle occlusie van de femorale slagader moet het krimpen terwijl hetzelfde in de femorale ader dient snel te vullen.
- Bevestig de onderkant van de tissue engineering kamer onder arterioveneuze lus met laatstgenoemde rust in zijn natuurlijke positie zonder draaien of knikken.
- Bevestig de basis van de kamer naar de lies ligament en de onderliggende spier fascia met 6/0 nylon hechtingen.
- Plaats het deksel over debasis, zodat de femorale vaten voer de kamer door een inkeping (venster in de zijde van de kamer). Bij het sluiten van de klep, zorg ervoor dat het vangt de epigastrische takken, tussen de kamer basis en deksel, die fungeren als aanbinden om de arterioveneuze lus te houden in de juiste positie.
- Sluit de wond met behulp van continu draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee of drie extra eenvoudige onderbroken steken.
- Laat het dier om te herstellen van narcose op een warming pad.
- Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Ook niet een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld terugkeren. 24 uur later, bestuurt een enkelvoudige dosis Carprofen (5 mg / kg, subcutaan) als analgeticum.
- Behandel de wond met actuele antibiotische zalf voor 5 dagen. Als de wond wordt geopend, verdoven van het dier in stap 1.1.2 tot 1.1.5 en sluit de wond in 1,30,14. Controleer de gezondheid van dieren dagelijks. Inslapen het dier met een dodelijke dosis lethabarb intraperitoneale injectie (163 mg / kg in 0,25 ml van 23 G naald) indien het dier toont meerdere matige tekenen van inacitivity, slechte eetlust, gewichtsverlies en kleurverlies.
2. Flow-through Pedicle Chamber (twee kamers per dier)
- Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
- Herhaal de stappen 1.1.1 tot 1.1.4. Twee kamers kunnen worden geïmplanteerd in beide lies gebieden van een rat.
- Isolatie van Femorale schepen en het inbrengen van de Kamer
- Herhaal de stappen 1.2.1 tot 1.2.8.
- Met zowel slagader en ader volledig bevrijd van de omliggende weefsels en hun filialen afgebonden, brengen de kamer in het operatiegebied.
- Plaats elk van de intacte femorale schepen op de overeenkomstige gleuf van de kamer basis om ervoor te zorgen dat er geen wendingen of knikken.
- Sluit de kamer door attaching het deksel op de basis. Sluiting van de wond met een continue draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee à drie eenvoudige onderbroken hechtingen en dat de dieren herstellen zoals eerder beschreven.
3. Oogst van Chambers en Tissue Processing
- Zodra het experiment tijdstippen (4-6 weken na implantatie) worden bereikt, verdoven het dier als in stap 1.1.2 en herhaal stappen 1.1.3 tot 1.1.5.
- Open de wond met een # 15 blad en doorsnijden van de weefsels met een schaar tot de kamer geheel is blootgesteld.
- Expose de femorale vaten proximale naar het construct en test voor vasculaire doorgankelijkheid: voorzichtig af te sluiten van het schip met twee microforceps, dan is melk het bloed in een distale richting en tenslotte de proximale tang los. Als het vat vult met bloed opnieuw, dit bevestigt doorgankelijkheid. Ligeren de femorale vaten proximaal bij de arterioveneuze lus en zowel proximaal als distaal bij The doorstroom configuratie, en verwijder de kamers met die weefsel en bloc.
- Na afloop van het experiment inslapen het dier met een dodelijke dosis lethobarb intraperitoneale injectie (163 mg / kg in 0,25 ml van 23 G naald).
- Fix weefsels in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verdeel weefsels in meerdere dwarsprofielen (1-2 mm dik) en insluiten in paraffine of optimale snij-temperatuur compound voor paraffine secties (5 pm) of bevroren secties (10 pm), respectievelijk. 3,4,8,17,22, 24
- Routinematige histologische kleuring zoals hematoxyline en eosine de algemene morfologie van weefsel te onderzoeken. Voer immunohistochemische kleuring met een specifiek antilichaam tegen celtype van belang, 3,4,8,17,22,24,29 identificeren bijvoorbeeld troponine T immunokleuring voor hartspiercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De microchirurgische creatie van tissue engineering kamers werd uitgevoerd zoals beschreven in het protocol hierboven. Weefsels gegenereerd in de kamers kunnen histologisch worden onderzocht beschrijven protocol stap 3. De diverse weefseltypen zijn met succes geconstrueerd met behulp van de in vivo gevasculariseerde kamer (figuur 2). Deze omvatten hartweefsel neonatale cardiomyocyten van de rat (Figuur 2A), spierweefsel rat skeletmyoblasten (figuur 2B), en vetweefsel met een hydrogel afgeleid van vetweefsel extracellulaire matrix (figuur 2C).
Morfometrische evaluatie van de weefsels kan worden uitgevoerd met ofwel een stereo onderzoeker systeem of ImageJ software. 3,4,8,17,22,29 Naast kwalitatieve beoordeling van verschillende weefsel componenten, het stereologie Voorts blijven ook onpartijdige kwantificeringcatie van specifieke volume weefsel. Bijvoorbeeld lectine (een marker voor knaagdieren endotheliale cellen) gekleurd dwarsprofielen (figuur 3) kan worden gebruikt om het vasculaire volume van de geoogste weefselconstructen behulp videomicroscopie met stereologie systeem schatten. Vertaald kwantificeringsmethoden kunnen worden toegepast om het volume van andere weefseltypen beoordelen.
De weefselmanipulatie kamers kunnen ook worden gebruikt voor spoorvolging lot van de cel in vivo implantatie. Cellen kunnen vooraf worden gemerkt met fluorescerende kleurstoffen zoals Dil, PKH26 of quantum dots voor implantatie. Zo kan neonatale cardiomyocyten van de rat gelabelde met Dil worden gedetecteerd in de weefselconstructen geoogst 3 dagen na implantatie (figuur 4A). We hebben ook met succes gevolgd geïmplanteerde cellen die vooraf zijn gemerkt met Dil tot 4 weken na implantatie. Alternatief kunnen species-specifieke antilichamen worden gebruikt identify geïmplanteerde cellen in xenotransplantatie studies. Bijvoorbeeld kan humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen geïmplanteerd in weefselmanipulatie kamers in immuungecompromitteerde ratten in het geoogste weefsel constructen worden geïdentificeerd met immunokleuring met humaan-specifieke Ku80 antilichaam (Figuur 4B).
Figuur 1: Cardiac tissue engineering met de in vivo doorbloed kamer Intrinsic vascularisatie aanpak met arterioveneuze lus kamer model en doorstroming pedikel kamer model.. De kamers werden uit ofwel polycarbonaat of polyacryl zijn deze materialen geteste niet-ontstoken en niet-toxisch in vivo. Schaal bar = 5 mm. Re-bedrukt met toestemming van 30. Pleidooi se klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Weefsels gefabriceerd dat in vivo gevasculariseerde kamers (A) Hartweefsel neonatale cardiomyocyten van de rat. Hartspiercellen werden immunostained met troponine T antilichaam (bruin). (B) Spierweefsel met rat skeletmyoblasten. Spiercellen werden immunostained met desmine antilichaam (bruin). (C) Vetweefsel met een hydrogel afgeleid van vetweefsel extracellulaire matrix. 31 hematoxyline en eosine kleuring. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Figuur 3: vasculariteit van een weefsel constructies geoogst 4 weken na de implantatie Vertegenwoordiger beelden van lectine gekleurde coupes.. De bloedvaten ontspruit uit de dijbeenslagader (*) werden gemerkt met lectine (bruin). Schaal bar = 200 micrometer (links) en 100 micrometer (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Identificatie van getransplanteerde cellen in het weefsel constructies (A) DII-label neonatale rat cardiomyocyten (rode en witte pijlen) in een rat weefsel construct geoogst 3 dagen na implantatie. Een vertegenwoordiger van Human-specifieke Ku80 gekleurd histologie beeld van een weefsel construct geoogst uit een rat tissu (B)e-engineering kamer geïmplanteerd met humane geïnduceerde pluripotente stamcellen op 28 dagen na implantatie. Human kernen werden immuno-gelabeld bruin en immuungecompromitteerde rat werd gebruikt om afstoting van menselijke cellen voorkomen. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Engineering van de microcirculatie wordt momenteel hoofdzakelijk wordt onderzocht door middel van twee benaderingen. De eerste omvat de ontwikkeling van een sterk onderling verbonden vasculaire netwerk binnen het construct in vitro zodat wanneer geïmplanteerd, capillairen van de gastheer vaatbed verbinden met die van de getransplanteerde construeren door een proces genaamd inoculatie, waardoor de levering van voedingsstoffen niet alleen de omtrek maar ook de kern. 21,32,33 Dit wordt pre-vascularisatie. De tweede benadering probeert eigen vaatstelsel van de gastheer direct in vivo te verbeteren, zodat de capillaire kiemen plaatsvindt vóór of gelijktijdig met geïmplanteerde celdifferentiatie en weefsel groei. 17,34
De in vivo tissue engineering kamer protocol hier gepresenteerde maakt gebruik van de laatste begrip door het plaatsen van een slagader en een ader, hetzij als een arterioveneuze lus of een flow-through pedikel configuratie,in een beschermde lege ruimte, waardoor aanzienlijke kiemen en de vorming van nieuwe haarvaten in de tijd 3 Voordelen van de kamer omvatten (1) het ontbreken van in vitro manipulaties.; (2) het genereren van een volledig autologe vasculaire netwerk dat niet door de host worden verworpen en (3) het feit dat zij geen inoculatie periode die tussen 1-7 dagen duren waardoor de weefselconstruct gevoelig voor ischemie nodig heeft. 35,36
Niettemin moet worden opgemerkt dat het duurt ongeveer 3-7 dagen voor belangrijke capillaire kiemen voor te komen, een periode waarin de geïmplanteerde weefsel wordt ook slecht geleverd. 3 Vertraagde cel implantatie zodra de kamer wordt adequaat gevasculariseerd is in feite aangetoond verbeterde overleving. 17 Een verder voordeel omvat de biocompatibiliteit en niet-immunogeniciteit van materiaal de kamers (dwz polycarbonaat en polyacryl). Bovendien, de starre niet samenvouwbare chamber verschaft een beschermde ruimte voor het weefsel en bloedvaten kunnen groeien zonder samenvoegen en integreren met de omgeving, die anders zouden belemmeren expansie en maakt oogst van het nieuw gevormde weefsel moeilijk. Daartegenover kan het feit dat de kamers worden afgesloten weefselgroei beperken. Dit is echter besproken in de arterioveneuze lusmodel, dat nu gebruikt een geperforeerde kamer die is aangetoond dat het weefsel beter groeien dan gesloten is. 37
De tissue engineering kamer protocollen die hier zijn zeer reproduceerbaar, maar het moet worden benadrukt dat de kamers zelden te vullen tot voltooiing, meestal tot ongeveer 70% van de capaciteit. Consistente resultaten worden bereikt op voorwaarde dat een aantal kritische stappen en technische kwesties in aanmerking worden genomen. Pedikel doorgankelijkheid is het uiteindelijke doel bij het werken met de bloedvaten, vooral als microchirurgische anastomosen worden uitgevoerd. We hebben consequent vonden geen weefsel groeit als de Vascheid op pedikel trombose vroege post-operatie. Factoren die van invloed doorgankelijkheid kan grofweg worden ingedeeld in vier categorieën, te weten chirurgische technische, de doorbloeding, trombose en spasmen.
Eerst wordt een delicate chirurgische techniek is de sleutel tot succes. In dit opzicht moet worden opgemerkt dat deze procedures, vooral die van het openen van een arterioveneuze lus is een zekere mate van chirurgische vaardigheid die gemakkelijk door eerst werkzaam in niet-levende modellen en vervolgens in femorale vaten van de rat volgende worden verworven de principes en technieken die hier en elders beschreven. 38 Schade aan de vaatwand, met name de intima, moet worden vermeden ten allen tijde door de correcte afhandeling van de schepen, die nooit grijpen de volledige dikte van de vaatwand, waardoor buitensporige stretching, oordeelkundige omvat gebruik van de bipolaire coagulator en bij arterioveneuze lus prestaties zorgvuldige en atraumatische microchirurgische anastomose. Hoewel spoelen met gehepariniseerde zoutoplossing helpt stolling te voorkomen, zal het nooit vervangen door een geldboete chirurgische techniek. Ten tweede, de doorbloeding factoren hebben voornamelijk betrekking op turbulentie en stasis. Turbulente stroming secundair aan wendingen, bochten of knikken van de schepen bevordert trombusvorming. Daarom is een stroomlijn onbeperkte stroom moet worden gewaarborgd in zowel de arterioveneuze lus en de doorstroming modellen. In die zin is de tethering effect van de epigastrische takken in de arterioveneuze lusmodel essentieel hoeft niet te buigen; als om welke reden deze takken kunnen niet worden gebruikt, eenvoudige 10/0 nylon steken van de vaatwand om de omringende weefsels zorgvuldig worden in plaats daarvan geplaatst. Statische bloed bij de anastomotische plek in de arterioveneuze lus procedure is ook zeer trombogeen en moet worden voorkomen door spoelen het vaartuig stevig met gehepariniseerde zoutoplossing vóór en tijdens de anastomose. Ten derde pro-thrombotische factoren zoals verontreinigingen uit het operatiegebied en meest importantly aanwezigheid van stukjes adventitia binnen de anastomose te vermijden. De voorbereiding van het vat eindigt juist voorafgaand aan microchirurgische hechten en het houden van het veld en anastomose schoon door regelmatig te spoelen zijn belangrijke aspecten om te overwegen wanneer de bouw van de arterioveneuze lus. Last but not least, is er de kwestie van het vaartuig spasmen. Hoewel de pathofysiologie van vaatspasmen niet volledig is opgehelderd, is het waarschijnlijk door lokale en systemische factoren zijn. Locale factoren omvatten bloedvattrauma, aanwezigheid van bloed in het operatiegebied en weefsel uitdroging. Systemische factoren, anderzijds, omvatten lage kerntemperatuur, hypotensie en sympathische reactie op pijn. 38
Dus zowel arterioveneuze lus en doorstroming modellen juiste behandeling en bereiding van het dier met een delicate chirurgische techniek kan niet genoeg benadrukt worden. Strategieën om spasmen te lossen onder meer irrigatie met warme zoutoplossing of onverdund1% Xylocaine en met een rust periode van 5-10 min. Vat dilatatie en strippen van de adventitia kan ook helpen om spasmen te verlichten veroorzaakt door de lokale sympathectomie effect. 38 Om de noodzaak van microchirurgische anastomose en de technische uitdaging impliceert uitvoeren omzeilen, kan de manchet techniek worden toegepast zoals elders beschreven. 39 Deze techniek bestaat van het plaatsen van een van het vat eindigt in een manchet Evert het en zet hem vast met een omtrek 6/0 nylon hechtdraad. Vervolgens wordt het andere uiteinde vat geschoven via manchet en bevestigd op dezelfde wijze.
De tissue engineering kamer heeft een nieuw venster van mogelijkheden in experimenteel onderzoek geopend en gestaag het bevorderen van de richting van een mogelijke klinische doel. Tot nu toe zijn de hier gepresenteerde modellen voornamelijk gebruikt voor het genereren van weefsels van verschillende geslachten. 4,7,8,17,22, 24,25,27-29,37,40 Maar ze hebben een aantal andere mogelijke toepassingen. Bijvoorbeeld, we have gebruikt het doorstroomkanaal kamer als een effectieve en relatief snel model teratoom vormen na implantatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. 41,42 Aldus kan deze benadering worden gebruikt als een "kwaliteitscontrole" hulpmiddel tumorvrij weefselmanipulatie verwezenlijken met pluripotente stamcellen. Ook zou drug toxicologische onderzoeken worden onderzocht in menselijke weefsels gegroeid binnen de kamer. Ook generatie van pathologische weefsel kan een interessante benadering van ziekte modellering en drugstesten opleveren. Ten slotte zou de tissue engineering kamer ook een potentiële model om de groei van het weefsel en het volgen van lot van de cel te bestuderen in vivo worden.
Concluderend, hebben wij een protocol waarbij de plaatsing van een subcutane ruimte bij dieren beschreven door middel van twee verschillende invalshoeken met een microchirurgische arterioveneuze lus of een doorstroming pedikel configuratie. De techniek is zeer reproduceerbaar en levert consistente resultaten. Het gebruik hals hoofdzakelijk benut op het gebied van weefselmanipulatie nu toe, maar er zijn andere potentiële onderzoeksgebieden waarvoor deze kamers kunnen van grote applicatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van NHMRC en Stafford Fox Medical Foundation. De auteurs erkennen de chirurgische hulp van Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos en Amanda Rixon van de experimentele medische en chirurgische Unit, St. Vincent's Hospital, Melbourne. Ondersteuning wordt ook verstrekt door Ministerie van innovatie, industrie de Victoriaanse staat regering en de operationele infrastructuur Support Program voor Regionale Ontwikkeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al.
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
