Abstract
I rekonstruktionskirurgi, der er et klinisk behov for et alternativ til de nuværende metoder til autolog genopbygning, som er komplicerede, dyre og handel en defekt for en anden. Tissue engineering holder løftet om at løse dette stigende efterspørgsel. Men de fleste væv engineering strategier undlader at generere stabile og funktionelle væv erstatninger på grund af dårlig vaskularisering. Dette papir fokuserer på et in vivo vævsmanipulation kammer model af iboende vaskularisering hvor en perfunderet arterie og en vene enten som en arteriovenøs sløjfe eller en gennemstrømning pedicle konfiguration ledes inde i et beskyttet hult kammer. I dette kammer-system sker angiogene spiring fra arteriovenøse skibe og dette system tiltrækker iskæmisk og inflammatorisk drevet endogene cellemigration som gradvist fylder kammeret med fibro-vaskulært væv. Eksogene celle / matrix implantation ved kammerets konstruktion forbedrer celle surVival og bestemmer specificiteten af de konstruerede væv, der udvikler. Vores undersøgelser har vist, at dette kammer model succes kan generere forskellige væv, såsom fedt, hjertemuskel, lever og andre. Dog er modifikationer og raffinementer nødvendige for at sikre målvævet dannelse er konsekvent og reproducerbar. Denne artikel beskriver en standardiseret protokol til fremstilling af to forskellige vaskulariserede vævsmanipulering kammer modeller in vivo.
Introduction
Bearbejdning funktionel vaskulariseret væv ved hjælp af en tissue engineering tilgang er en spirende paradigme i regenerativ medicin. 1,2 Mange tilgange til ingeniør nyt og sundt væv for udskiftning af skadede væv eller defekte organer er blevet udviklet, 3-6 eksperimentelt i små dyremodeller med lovende kliniske potentiale. 7,8 vaskularisering er dog fortsat en af de store udfordringer for tissue engineering begrænser dens potentiale til at vokse væv af klinisk relevant størrelse,. 9
Aktuelle tilgange til vaskularisere væv følge enten en ydre vej, hvor nye skibe vokser fra modtageren vaskulære seng og invadere hele implanterede væv konstruerer 10 eller en iboende vaskularisering sti, hvor vaskulaturen vokser og udvider i samklang med den nyligt udviklede væv. 11 Den ydre tilgang traditionelt involverer seeding celler på et stilladsin vitro og implantere hele konstruktionen i levende dyr med den forventning, at næringsstoffer, der tidligere leveret af dyrkningsmedier, vil blive indkøbt fra kredsløbet. 12,13 Konceptet er simpelt som vaskulær indvækst er for langsom, og kun meget tynde implantater (< 1-2 mm tyk) forbliver levedygtige. Forudsat næringsstoffer og ilt ved hjælp af en tilstrækkelig og hurtig vaskularisering er kernen i enhver vellykket forsøg på at vokse mere komplekse og større væv-manipuleret erstatninger såsom knogler, muskler, fedt og solide organer. 14,15 Intrinsic vaskularisering rummer muligheder for større konstruktioner til at udvikle ved progressiv vækst af væv rimeligt forhold til dets ekspanderende blodforsyning. Et design er in vivo implantation ind i et kammer af en vaskulær stilken med eller uden en celle seedede stillads. 5,6 Dette har banet vejen for nye procedurer for generering af tykkere uløseligt vaskulariserede væv. 16,17 </ P>
For nylig er strategier blevet udviklet til at pre-vaskularisere vævstransplantater, før implantation. Disse indarbejdet blodkarrenes netværk har til formål at inosculate med værten fartøjer på implantation giver mulighed for hurtig levering af en komplet blodforsyning for at forbedre overlevelsen af alle dele af et transplanteret tyk vævstransplantat. 18
Vi banebrydende en in vivo vaskulariseret væv teknisk model i små dyr, der involverer en subkutant implanteret halvstiv lukket rum indeholdende en perfunderes vaskulær stilken og celleholdige biomaterialer. Kammeret skaber et iskæmisk miljø, der stimulerer angiogene spiring fra de implanterede fartøjer. 3 Den vaskulære stilken kan enten være en rekonstrueret arteriovenøs sløjfe eller en intakt gennemstrømning arterie og vene. 3-6,19 Denne vaskulære pedicle spirer en velfungerende og omfattende arteriovenøse -capillary-venøs netværk, der forbinder både teknikkeneriole og venøs slutter med vaskulære stilken. 3,20 Endvidere omgivende hule bærekammeret beskytter det udviklende væv fra potentielt deformerende mekaniske kræfter og forlænger den iskæmiske drev kan forbedre vaskularisering. 3,21,22 Hvis fartøjet stilken simpelthen implanteres i normalt væv og ikke inde i beskyttede rum af kammeret, angiogene spiring ophører langs den samme tidslinje som en normal såret og ingen nye væv vil akkumulere omkring stilken. Forskere har anvendt denne in vivo konfiguration til frembringelse tredimensionale funktionelle vaskulariserede vævskonstruktioner med støttende vaskulatur og klinisk relevant størrelse. 4,23 Endvidere kan de manipulerede vaskulariserede vævskonstruktioner med dens intakte vaskulær pedicle høstes beregnet til udplantning på skadestedet . 24,25 En mere klinisk mulig scenarie ville være at skabe kammeret i den endelige site for genopbygning sn sådan som brystet. Således kunne denne de novo tissue engineering tilgang har klinisk potentiale til at tilvejebringe en ny kilde til funktionelle målvæv for rekonstruktionskirurgi. 26-28
Følgende protokol giver en generel vejledning til at konstruere en in vivo vaskulariseret vævsteknik kammer i rotter, som kunne tilpasses i forskellige dyremodeller og anvendes til at undersøge de indviklede processer angiogenese, matrixproduktion, og den cellulære migration og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De her beskrevne protokoller er blevet godkendt af Animal Ethics Committee of St. Vincents Hospital Melbourne, Australien, og blev gennemført under streng overholdelse af de australske National Sundhed og Medicinsk Research retningslinjer fra Rådet.
BEMÆRK: To kammer protokoller er beskrevet nedenfor. De to forskellige modeller og deres specifikke chamber designs er illustreret i figur 1. Chamber (1) er fremstillet af polycarbonat (for rotte-arteriovenøs loop kammer model). Det er cylindrisk med en indre diameter 13 mm og højde 4 mm. Et vindue på et tidspunkt i væggen giver uhindret adgang til stilken. I den anden model (for rotte-gennemstrømning pedicle kammer model), er kammeret fremstillet af polyacrylsyrederivater og er rektangulær (10 x 8 x 4 mm 3 indvendige mål). Det har to 1,5 mm åbninger på modstående sider til at rumme den femorale arterie og vene som de overtræder kammeret.
1. Rat arteriovenøse Loop Chamber Model (One Chamber Per Animal)
BEMÆRK: Inden du starter kirurgi, skal du sørge for alle de instrumenter er blevet korrekt steriliseret. Ligeledes sikre instrumenter resten på sterile håndklæder og er i en rimelig afstand fra det kirurgiske felt for at undgå forurening under proceduren.
- Forberedelse af Animal for Kirurgi
- Brug rotter vejer mindst 250 g for deres store størrelse af skibe til oprettelsen af arteriovenøse loop.
- Bedøve dyret med 4% isofluran inhalering. Bekræfte tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at vurdere passivitet til tå-knivspids. Efter anæstesi, holde dyret tilstrækkeligt bedøvet under hele proceduren med 2% isofluran.
- Placer dyret i liggende stilling på en opvarmning pad og anvende sterilt smøremiddel til øjnene for at forhindre udtørring under operationen.
- Ved anvendelse af en elektrisk barbermaskine, barbere begge stikkapper og fjerne hår med et stykke fugtig gaze.
- Prep de kirurgiske websteder med klorhexidin/ 70% ethanol-opløsning og drapere dyret med sterile håndklæder. Administrere en enkelt dosis Carprofen (5 mg / kg, subkutant) som analgetikum.
- Høst af femorale vene Graft
- Ved hjælp af en # 15 klinge, lave en 4 cm lang incision i huden på den venstre lyske parallelt lyskeligamentet. Dette udsætter lyskelymfeknuder fedt pad.
- Skær gennem fedt puden omkredsen med en saks forlader det knyttet til sin vaskulær stilken baseret på epigastriske skibe.
- Ved hjælp af mikro saks, befri filmagtige bindevævsceller sammenvoksninger mellem bugvæggen og underliggende femorale fartøjer.
- Placer en retractor på bugvæggen og træk medialt. Dette udsætter lyskeligamentet og hele længden af de femorale kar.
- Brug mikro pincet og buede sakse dissekere epigastriske vene og isolere den fra dens omgivende fedt ved forsigtigt at trække og skæring. Denne vene fungerer som et tøjr, når konstruere løkken.
- B rugG Micro pincet og buede mikro saks åbne perivaskulær hylster indeholder de femorale kar og nerve hele vejen fra lyskeligamentet til dens bifurkation distalt for epigastriske gren.
- Ved hjælp af mikro pincet, afhente den femorale vene ved sin adventitia og forsigtigt adskille den fra det omgivende væv og ledsagende arterie. Gør dette med mikro pincet og buede runde-pegede mikro saks ved at trække vævet fra hinanden og skære igennem den.
BEMÆRK: Aldrig fat i hele tykkelsen af venen væggen, da dette kan forårsage traumer til intima gør den sårbar over for trombose. - Afsnøre sidegrene fundet under dissektion med 10/0 nylon sutur eller koagulerer dem med en bipolar koagulator.
- Med den femorale vene helt fri, ligere dets proximale og distale ender med 4/0 silkesuturer. Sørg for at opnå en venegraft på mindst 10 mm længde og omfatter ca. 0,5 cm længde epigastriske gren, der skal anvendes som en bardun tøjrat holde løkken åben i kammeret.
- Brug mikro pincet og lige mikro saks, trim adventitia fra graft s ender ved forsigtigt at trække og skæring. Dette kan også gøres senere, før mikrokirurgiske anastomoser.
- Skyl venegraft med hepariniseret saltvandsopløsning (10 U / ml heparin), og lad den hvile i opløsningen. Luk såret ved hjælp af kontinuerlig drift 4/0 silke sutur plus to eller tre yderligere simple afbrudte sting.
- Oprettelse af arteriovenøse Loop og Implantation af Chamber
- Gentag trin 1.2.1 til 1.2.4 i nøjagtig samme måde på den kontralaterale ekstremitet.
- Ved hjælp af mikro pincet, dissekere og isolere både epigastriske arterie og vene danne omgivende fedt pad. Gør dette ved forsigtigt at trække vævet væk fra skibene
- Ved hjælp af mikro pincet, afhente den femorale arterie ved sin adventitia og gratis det fra det omgivende væv. Gør dette med mikro pincet og buede runde-takkede mikrofonro saks ved at trække vævet fra hinanden og skærer gennem det. Ligere eller koagulere sine sidegrene.
- Ligere den femorale arterie og vene distalt for fremkomsten af epigastriske fartøjer, der anvender 4/0 silke sutur.
- Placer et enkelt klemme proksimalt på hver af den femorale arterie og vene. Ved hjælp af en skarp lige mikro saks, lave en ren tværgående skåret i hvert fartøj distalt for fremkomsten af epigastriske grene. Placer en steril plastik kontrast baggrundsviden på fartøjerne.
- Skyl beholderne kraftigt med generøse mængder af hepariniseret saltvand indtil alt blodet fjernes fra hulrummet.
- Bring venegraft i operationsfeltet og fjerne overflødige adventitia fra skibenes ender som pr trin 1.2.10, hvis det er nødvendigt.
- Udfør både mikrokirurgiske anastomoser med 10/0 nylon sutur. Anastomose den proximale ende af venegraft til den femorale vene og den distale ende til den femorale arterie. Dette vil gøre det muligt for blodet at strømme from arterielle til den venøse side uden modstand fra ventiler inde i venegraft.
BEMÆRK: Sørg for, femorale skibe og venegraft hvile i deres naturlige stilling uden snoninger. - Check for utætheder i begge anastomotiske områder. Løse små lækager, der ligner ikke-pulserende blod kommer ud af det anastomotiske sted, ved at placere et lille stykke af fedt på toppen og forsigtigt komprimere i 5-10 min. Større pulserende lækager, som hurtigt oversvømme hele feltet der brug for yderligere sting.
- Check åbenheden af arteriovenøse loop. Blid okklusion af arteria femoralis skulle gøre det krympe medens den samme i den femorale vene bør engorge det.
- Placer bunden af vævsopbygning kammeret under arteriovenøse loop med sidstnævnte hvilende i sin naturlige position uden snoninger eller sløjfer.
- Fastgør bunden af kammeret til lyskeligamentet og underliggende muskelfascie med 6/0 nylon suturer.
- Placer låget overbase, så de femorale sejler ind i kammeret gennem et hak (vindue i siden af kammeret). Når du lukker låget, sørg for at det fanger epigastriske grene, mellem kammeret base og låg, der fungerer som bindsler til at holde arteriovenøs loop på plads.
- Luk såret ved hjælp af kontinuerlig drift 4/0 silke sutur plus to eller tre yderligere simple afbrudte sting.
- Lad dyret kan komme sig anæstesi på en opvarmning pad.
- Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Ligeledes ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. 24 timer senere, administrere en anden enkelt dosis Carprofen (5 mg / kg, subkutant) som analgetikum.
- Behandl såret med topisk antibiotisk salve i 5 dage. Hvis såret er åbnet, bedøver dyret som i trin 1.1.2 gennem 1.1.5 og lukke såret som i 1.30,14. Overvåg helbred dyr dagligt. Aflive dyret ved hjælp af en dødelig dosis af intraperitoneal lethabarb injektion (163 mg / kg i 0,25 ml med 23 G nål), hvis dyret viser mere end en moderat tegn på inacitivity, dårlig appetit, vægttab og tab af farve.
2. Flow-through stilken Afdeling (to kamre pr Animal)
- Forberedelse af Animal for Kirurgi
- Gentag trin 1.1.1 gennem 1.1.4. To kamre kan implanteres i begge lyske regionerne i de enkelte rotte.
- Isolering femoral Fartøjer og Indsættelse af mødesalen
- Gentag trin 1.2.1 gennem 1.2.8.
- Med både arterie og vene helt befriet for omgivende væv og deres filialer ligeret, bringe kammeret ind i det operative felt.
- Placer hver af de intakte femorale skibe på den tilsvarende spalte af kammeret basis at sørge for der er ingen snoninger eller knæk.
- Kammeret lukkes ved attaching låget til bunden. Luk såret ved hjælp af kontinuerlig drift 4/0 silke sutur plus to eller tre yderligere enkle afbrudte sømme og så dyret kan komme sig som tidligere beskrevet.
3. Høst af Chambers og Tissue Processing
- Når eksperimentets tidspunkter (4-6 uger efter implantation) er nået, bedøver dyret som i trin 1.1.2 og gentag trin 1.1.3 gennem 1.1.5.
- Åbne såret ved anvendelse af en # 15 blad og skære gennem vævene med en saks, indtil kammeret er helt åbent.
- Udsætte femorale fartøjer proximalt til konstruktionen og test for vaskulær åbenhed: forsigtigt okkluderer karret med to microforceps, derefter malke blod i en distal retning og endelig frigive de proksimale pincet. Hvis fartøjet fyldes med blod igen, dette bekræfter åbenhed. Ligere femorale fartøjer proximalt i tilfældet med den arteriovenøse loop og både proksimalt og distalt i tilfælde af the gennemstrømning konfiguration, og fjern kamrene med indeholder væv en bloc.
- Ved slutningen af eksperimentet aflive dyret under anvendelse af en dødelig dosis af intraperitoneal lethobarb injektion (163 mg / kg i 0,25 ml med 23 G nål).
- Fix væv i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 24 timer. Opdel væv i flere tværgående sektioner (1-2 mm tyk) og integrere i paraffin eller optimale skære temperatur sammensatte for paraffinsnit (5 um) eller frosne snit (10 um), hhv. 3,4,8,17,22, 24
- Udfør rutine histologisk farvning såsom hæmatoxylin og eosin til at undersøge den generelle morfologi af væv. Udfør immunhistokemisk farvning med specifikt antistof for at identificere celletype af interesse, 3,4,8,17,22,24,29 for eksempel hjerte-troponin T immunfarvning for cardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mikrokirurgisk skabelse af vævsteknologiske kamre blev udført som beskrevet i protokollen ovenfor. Væv genereret inde i kamrene kan undersøges histologisk som beskriver i protokol trin 3. Forskellige vævstyper med succes er blevet udviklet ved hjælp af in vivo vaskulariserede kammer (figur 2). Disse omfatter hjertevæv med neonatale rottecardiomyocytter (figur 2A), muskelvæv med rotte skeletmyoblaster (figur 2B), og fedtvæv med en hydrogel afledt fra fedtvæv ekstracellulære matrix (Figur 2C).
Morfometrisk evaluering af vævene kan udføres med enten en stereo investigator system eller ImageJ software. 3,4,8,17,22,29 Foruden kvalitativ vurdering af forskellige vævskomponenter, den stereologi systemet giver også mulighed for unbiased kvantifikation af specifikke væv volumen. For eksempel lectin (en markør for gnaver endotelceller) farves tværsnit (figur 3) kan anvendes til at estimere den vaskulære volumen af de høstede vævskonstruktioner der anvender video mikroskopi med stereologi system. Lignende kvantificeringsmetoder kan anvendes til at vurdere omfanget af andre vævstyper.
De vævsteknologiske kamre kan også anvendes til at spore celle skæbne efter in vivo implantation. Celler kan præ-mærkede med fluorescerende farvestoffer, såsom Dil, PKH26 eller kvantepunkter før implantation. For eksempel kan detekteres neonatale rottecardiomyocytter pre-mærket med DiI i vævskonstruktioner høstet ved 3 dag efter implantation (figur 4A). Vi har også med succes sporet implanterede celler, der er blevet præ-mærket med Dii i op til 4 uger efter implantation. Alternativt kan artsspecifikke antistoffer anvendes til identify implanterede celler i xenotransplantation undersøgelser. For eksempel kan humane inducerede pluripotente stamceller implanteres inde vævsteknologiske kamre i immunokompromitterede rotter identificeres i de høstede vævskonstruktioner ved immunofarvning med human-specifik Ku80 antistof (figur 4B).
Figur 1: Cardiac tissue engineering med in vivo vaskulariserede kammer Intrinsic vaskularisering tilgang med arteriovenøs loop kammer model og gennemstrømning pedicle kammer model.. Kamrene blev fremstillet af enten polykarbonat eller polyacryl, blev disse materialer testet til at være ikke-inflammatorisk og ikke-toksiske in vivo. Scale bar = 5 mm. Re-trykt med tilladelse fra 30. Anbringende se klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Væv manipuleret fra in vivo vaskulariserede kamre (A) Cardiac væv med neonatale rottecardiomyocytter. Cardiomyocytter blev immunofarvet med kardiel troponin T-antistof (brun). (B) Muscle væv med rotte skeletmyoblaster. Muskelceller immunfarvet med desmin-antistof (brun). (C) Fedtvæv med en hydrogel afledt fra fedtvæv ekstracellulære matrix. 31 Hæmatoxylin og eosin-farvning. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Figur 3: vaskularisering af et vævskonstruktioner høstet efter 4 uger efter implantation Repræsentative billeder af lectin-farvede snit.. Blodkarrene spiring fra den femorale arterie (*) blev mærket med lectin (brun). Scale bar = 200 um (til venstre) og 100 um (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Identifikation af transplanterede celler i vævskonstruktioner (A) Dil-label neonatale rottecardiomyocytter (rød og hvide pile) i en konstruktion rottevæv høstet 3 dage efter implantation. (B) En repræsentativ human-specifik Ku80 farves histologi billede af en vævskonstruktion høstet fra en rotte tissue engineering kammer implanteret humane inducerede pluripotente stamceller ved 28 dage efter implantation. Humane kerner blev immuno-mærket brun og immunokompromitterede rotte blev anvendt til at forhindre afstødning af humane celler. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Engineering af mikrocirkulationen undersøges i øjeblikket hovedsagelig gennem to tilgange. Den første indebærer at udvikle en yderst sammenhængende vaskulære netværk inden konstruktionen in vitro så når implanteret, kapillærer fra værten vaskulære seng forbinde med dem i den transplanterede konstruere gennem en proces kaldet inosculation, hvilket sikrer levering af næringsstoffer, ikke kun til periferien, men også til kernen. 21,32,33 Dette kaldes præ-vaskularisering. Den anden fremgangsmåde forsøger at forbedre værtens egen vaskulatur direkte in vivo, således at kapillær spiring forekommer enten før eller samtidigt med implanterede celledifferentiering og vævsvækst. 17,34
In vivo vævsteknik kammer protokol præsenteres her udnytter sidstnævnte begreb ved at placere en arterie og en vene, enten som en arteriovenøs sløjfe eller en gennemstrømning stilken konfiguration,inde i et beskyttet tom plads, tillader en betydelig spiring og dannelse af nye kapillærer over tid 3 Fordele ved kammeret indbefatter (1) mangel på in vitro manipulationer.; (2) generering af en helt autolog vaskulære netværk, som ikke vil blive afvist af værten; og (3) at det ikke behøver en inosculation periode, som kan tage mellem 1 til 7 dage gør vævet konstruere tilbøjelige til iskæmi. 35,36
Ikke desto mindre skal det bemærkes, at det tager omkring 3-7 dage for betydelig kapillær spiring at forekomme, en periode, hvor det implanterede væv også dårligt leveret. 3 Forsinket celle implantation, når kammeret er tilstrækkeligt vaskulariseret faktisk har vist forbedret overlevelse. 17 En yderligere fordel omfatter biokompatibilitet og ikke-immunogenicitet af kamrene 'materiale (dvs. polycarbonat og polyacryl). Derudover stive ikke-sammenklappelig chamber giver et beskyttet rum for vævet og vaskulatur til at vokse uden at samle og integrere med det omgivende miljø, som ellers ville hæmme ekspansion og gøre høst af det nydannede væv vanskelig. I modsætning hertil kan den omstændighed, at kamrene er lukket begrænse vævsvækst. Dette er imidlertid blevet behandlet i arteriovenøse loop model, som nu anvender et perforeret kammer, som har vist sig at vokse væv mere effektivt end den lukkede ene. 37
De vævsmanipulering kammer protokoller præsenteres her er meget reproducerbar, men det skal understreges, at kamrene sjældent fylde til afslutning, normalt til ca. 70% kapacitet. Ensartede resultater opnås forudsat at der træffes nogle kritiske trin og tekniske spørgsmål i betragtning. Stilken åbenheden er det endelige mål, når der arbejdes med blodkar, især hvis mikrokirurgiske anastomoser udføres. Vi har konsekvent fundet nogen væv vokser, hvis vascgelmæssige pedicle trombose tidlig post-kirurgi. Faktorer, der påvirker åbenhed kan groft inddeles i fire kategorier, nemlig kirurgisk tekniske, blodgennemstrømning, trombose og krampe.
Først en delikat kirurgisk teknik er nøglen til succes. I denne henseende skal det bemærkes, at disse procedurer, især den ene består i at oprette en arteriovenøs løkke kræver en vis grad af kirurgisk dygtighed, som let kan erhverves ved at øve først i ikke-levende modeller og efterfølgende i rottens femorale fartøjer efter de principper og teknikker, der er beskrevet her og andre steder. 38 Skader på karvæggen, især intima, skal undgås på alle tidspunkter ved korrekt håndtering af skibene, som omfatter aldrig snuppe den fulde tykkelse af karvæggen, forhindre overdreven strække, velovervejet anvendelse af den bipolære koagulatoren, og i tilfælde af arteriovenøse loop, udførelse af omhyggelige og atraumatiske mikrokirurgiske anastomoser. Selvom gennemskylning med hepariniseret saltvand hjælper med at forhindre koagulation, vil det aldrig erstatte et fint kirurgisk teknik. For det andet, blod flow faktorer vedrører hovedsageligt til turbulens og stasis. Turbulent flow sekundært til snoninger, bøjninger eller knæk af fartøjer fremmer trombedannelse. Derfor skal sikres en strømline ubegrænset flow i både arteriovenøs loop og gennemstrømning modeller. I den forstand, at tethering effekt epigastriske grene i arteriovenøs loop model er afgørende for at forhindre bøjning; hvis en eller anden grund ikke kan bruges disse grene, bør simple 10/0 nylon masker fra karvæggen til de omgivende væv omhyggeligt placeret i stedet. Statisk blod ved det anastomotiske sted under arteriovenøse loop procedure er også meget thrombogen og skal forhindres ved at skylle beholderen kraftigt med hepariniseret saltvand før og under anastomosen. For det tredje, pro-trombotiske faktorer, såsom kontaminanter fra operationsfeltet og mest importantly tilstedeværelsen af stykker af adventitia inde i anastomose skal undgås. Klargøring af skibet ender korrekt forud for mikrokirurgisk sutur og holde feltet og anastomose ren ved at skylle regelmæssigt vigtige aspekter at overveje, når konstruere arteriovenøs loop. Sidst men ikke mindst, er der spørgsmålet om fartøjets spasmer. Selvom patofysiologien af fartøjet spasmer ikke er blevet fuldstændig klarlagt, er det sandsynligt at skyldes både lokale og systemiske faktorer. Lokale faktorer omfatter fartøj traumer, tilstedeværelse af blod i operationsfeltet og væv udtørring. Systemiske faktorer, på den anden side, omfatter lav kernetemperatur, hypotension og sympatisk reaktion på smerte. 38
Således i både arteriovenøs loop og flow-through modeller, korrekt håndtering og forberedelse af dyret sammen med en delikat kirurgisk teknik kan ikke understreges nok. Strategier til at løse krampe omfatter vanding med varmt saltvand eller ufortyndet1% xylocain og have en hvileperiode på 5-10 min. Vessel dilatation og stripning af adventitia kan også bidrage til at lindre spasmer på grund af sin lokale sympathectomy effekt. 38 For at omgå behovet for at udføre mikrokirurgiske anastomoser og teknisk udfordring det indebærer, kan manchetten teknik anvendes som beskrevet andetsteds. 39 Denne teknik består at indsætte en af skibets ender i en manchet, krænge det og fastgør den med et perifert 6/0 nylon sutur. Dernæst andet fartøj ende at glide ind over manchetten og fastgjort på en lignende måde.
Den vævsmanipulering kammer har åbnet et nyt vindue af muligheder i eksperimentel forskning og er støt fremskridt i retning af en potentiel klinisk formål. Indtil nu har de modeller, der præsenteres her hovedsagelig været anvendt til generering af væv fra forskellige slægter. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 desto mindre de har en række andre potentielle anvendelser. For eksempel, vi hahar brugt den gennemstrømningskammeret som en effektiv og forholdsvis hurtig model for teratom dannelse efter implantation af humane inducerede pluripotente stamceller. 41,42 Således kan denne fremgangsmåde anvendes som en "kvalitetskontrol" værktøj til at opnå tumor-fri vævsmanipulering med pluripotente stamceller. Også kunne drug toksikologiske undersøgelser udforskes i humane væv dyrket inde i kammeret. Ligeledes kunne generation af patologisk væv giver en interessant tilgang til sygdom modellering og test af lægemidler. Endelig kan den vævsmanipulering kammer også blevet en potentiel model til at studere vækst af væv og sporing af celle skæbne in vivo.
Som konklusion har vi beskrevet en protokol, der involverer placering af en subkutan kammer i dyr via to forskellige fremgangsmåder: anvendelse af en mikrokirurgisk arteriovenøs løkke, eller en gennemstrømnings-pedicle konfiguration. Teknikken er meget reproducerbar og giver ensartede resultater. Dens anvendelse hsom er blevet udnyttet primært inden for vævsmanipulation hidtil, men der er andre potentielle forskningsområder, for hvilke disse kamre kan være af stor anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NHMRC og Stafford Fox Medical Foundation. Forfatterne anerkender den kirurgiske bistand fra Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos og Amanda Rixon af Experimental Medicinsk og Kirurgisk Enhed, St. Vincents Hospital, Melbourne. Der ydes også støtte af den victorianske State regeringens Institut for Innovation, Industri og regional udvikling driftsupportsystemer Infrastructure Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al.
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
