استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق<em> الدودي Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
عزل الفيروسات العملاقة هي ذات أهمية كبيرة في هذا العصر الجديد من الفيروسات، وخاصة لأن هذه الفيروسات العملاقة ترتبط الطلائعيات. قد تكون الفيروسات العملاقة المحرضة للعديد من أنواع الطلائعيات. وهم ينتمون إلى أجل وصف مؤخرا من Megavirales. سلالة جديدة Faustovirus التي تم عزلها من عينات مياه الصرف الصحي غير بعيدة الصلة إلى الممرض الثدييات الخنازير الأفريقية فيروس الحمى. هذا الفيروس هو أيضا محددة لاستضافة amoebal لها، الدودي Vermamoeba، وأولاني المشتركة في شبكات المياه والرعاية الصحية. ومن الأهمية بمكان أن تواصل عزل المورثات Faustovirus جديدة من أجل توسيع مجموعة النمط الوراثي ودراسة في عموم الجينوم. قمنا بتطوير استراتيجيات جديدة لعزل سلالات إضافية من خلال تحسين استخدام نوعين من المضادات الحيوية ومضادات الفطور وذلك لتجنب التلوث البكتيرية والفطرية من الاميبا ثقافة مشتركة وتفضيل تكاثر الفيروس. نحن أيضا نفذت starvatio جديدن المتوسطة للحفاظ على V. الدودي في الظروف المثلى للبحث عن الفيروسات شارك في الثقافة. وأخيرا، كنا التدفق الخلوي بدلا من الملاحظة المجهرية، التي تستغرق وقتا طويلا، للكشف عن تأثير ممرض للخلايا. حصلنا على اثنين من عزلات من عينات مياه الصرف الصحي، وتثبت كفاءة هذه الطريقة وبالتالي توسيع مجموعة من Faustoviruses، من أجل فهم أفضل بيئة، والنوعية التي تستضيفهم والمحتوى الجيني.
Introduction
اكتشاف الفيروسات العملاقة، وخاصة أولئك الذين ينتمون إلى أجل Megavirales، تغير تماما في عالم الفيروسات من حيث حجم الجسيمات والجينوم التعقيد. ويعتقد أن الفيروسات في السابق أن تكون الكيانات الصغيرة، وظهر فيروس محاكي لكسر جميع القواعد. وتشير 1 Metagenomic بيانات كل مكان من الفيروسات العملاقة ليس فقط في البيئة، 2-5 ولكن أيضا في البشر. 6 لذلك، لا يزال هناك حاجة للبحث عن هذه الفيروسات على نطاق واسع. وجرى تقييم للتنوع هذه الفيروسات العملاقة عن طريق أخذ عينات ليس فقط مجموعة متنوعة من البيئات المائية والرواسب المرتبطة بها في جميع أنحاء العالم، 11/07 ولكن أيضا عن طريق فحص مجموعة متنوعة من العينات البشرية 12،13 والعينات البيئية. كان 7،9 في فيروس محاكي polyphaga الشوكميبة معزولة عن طريق المشاركة في الثقافة باستخدام الأولانيات أكلة، في المقام الأول الشوكميبة النيابة 14-16 كانت هناك مجموعة كاملة من الفيروسات العملاقة ثم أيضامعزولة عن هذا المضيف أولاني محدد، مما جعل المجتمع العلمي تقييد إجراء البحوث وعزلتها عن الشوكميبة النيابة. بوضوح وقد أدى هذا الاعتماد على الأنواع المضيفة واحدة في جزء كبير من الفيروسات التي يجري تجاهلها. حقيقة أن الفيروس العملاق، CroV، تم عزل مع متحركة عالية البحرية roenbergensis كافتيريا البروتوزوا، 17،18 يوضح الحاجة إلى استخدام مجموعة واسعة من البروتوزوا من أجل اكتشاف سلالات جديدة أو الأسر من الفيروسات العملاقة. Reteno آخرون تمكنوا من تحديد الأوليات الأخرى بصفتها الدولة المضيفة الخلية التي لم تستخدم من قبل، وعزل النسب المتعلقة الأصفر ما هو جديد من الفيروسات العملاقة (المسماة حديثا Faustovirus). 19
في محاولة لعزل المورثات Faustovirus جديدة من أجل توسيع أعضاء هذه النسب الفيروسي، علينا تعديل الإجراءات عزلتنا واستخدموه لفحص عينات بيئية قادرة على حصاد Faustoviruses جديدة. نحن بعد ذلكوصف بروتوكول كامل لتوصيف السلالات الجديدة. قمنا بتقييم الدودي Vermamoeba، وجدت في بيئات الإنسان أولاني حرة المعيشة الأكثر شيوعا، 20-22 الذي يستخدم بالفعل في عزلة أول نموذج Faustovirus E12. 19 هذا أولاني حاليا لا تزال تستضيف محددة لFaustovirus. كنا نعلم أن أيا من الفيروسات العملاقة المعروفة والمسببة للأمراض لهذا الاميبا، لأنه لا يوجد محاولات لتنمو الفيروسات العملاقة الأخرى في مختبرنا أظهرت تحلل الأميبا أو النمو الفيروسي. لهذا السبب، فإننا نعتقد أن V. الدودي هو أفضل والأكثر تفردا دعم خلية معروفة لعزل Faustoviruses جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
احتمال أن Faustovirus يمكن أن يكون أول عضو من عائلة Megavirales جديدة قريبة من ASFV كان أول من اقترح من قبل Reteno وآخرون، 19 ولكن لا يزال من الممكن تمييز بعض الاختلافات. ويبدو واضحا ما إذا كانت Faustovirus أن تنضم إلى عائلة فيروسات حمى الخنازير الأفريقية وما يتصل بها أو ما إذا كا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
