En hurtig strategi for Isolering af nye Faustoviruses fra miljøprøver Brug<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
Isoleringen af gigantiske virus er af stor interesse i denne nye æra af virologi, især da disse gigantiske vira er relateret til protister. Giant vira kan være potentielt patogene for mange arter af protister. De tilhører den nyligt beskrevne rækkefølge Megavirales. Den nye slægt Faustovirus, som er isoleret fra spildevand prøver er fjernt beslægtet med den mammale patogen afrikansk svinepestvirus. Denne virus er også specifik for sin amoebal vært, Vermamoeba vermiformis, en protist almindelig i sundhedsvæsenet vandsystemer. Det er afgørende at fortsætte isolere nye Faustovirus genotyper for at udvide sin genotype indsamling og studere dens pan-genom. Vi udviklede nye strategier til isolering af yderligere stammer ved at forbedre brugen af antibiotika og antifungale kombinationer for at undgå bakterielle og fungale kontaminering af den amøbe co-kultur og begunstige virus multiplikation. Vi implementerede også en ny starvation medium for at opretholde V. vermiformis i optimale betingelser for virus co-kultur. Endelig brugte vi flowcytometri snarere end mikroskopisk observation, hvilket er tidskrævende, for at opdage den cytopatogene virkning. Vi opnåede to isolater fra spildevand prøver, der beviser effektiviteten af denne metode, og dermed udvide samlingen af Faustoviruses, for bedre at forstå deres omgivelser, host specificitet og genetiske indhold.
Introduction
Opdagelsen af gigantiske vira, især dem, der hører til Megavirales ordre, fuldstændig ændret verden af virus i form af partikelstørrelse og genom kompleksitet. Vira blev tidligere anset for at være mindre enheder, og mimivirus syntes at bryde alle regler. 1. metagenomisk data tyder det allestedsnærværende gigantiske vira ikke kun i miljøet, 2-5, men også hos mennesker. 6 Der er derfor stadig et behov at søge efter disse vira i stor skala. Mangfoldigheden af disse gigantiske vira blev vurderet ved prøveudtagning ikke kun en bred vifte af vandmiljøer og deres tilknyttede sedimenter på verdensplan, 7-11, men også ved at screene en lang række menneskelige prøver 12,13 og miljøprøver. 7,9 De Acanthamoeba polyphaga mimivirus var isoleret ved co-dyrkning under anvendelse af fagocytiske protister, primært Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling af gigantiske vira blev derefter ogsåisoleret fra den angivne protist vært, hvilket gjorde det videnskabelige samfund begrænse sin procedure for Acanthamoeba spp forskning og isolation. Klart dette afhængighed af en enkelt værtsart har resulteret i en stor del af virus bliver overset. Det faktum, at den gigantiske virus, CroV, blev isoleret med den meget bevægelige marine protozoer Cafeteria roenbergensis, 17,18 viser behovet for at bruge en bredere vifte af protozoer for at opdage nye slægter eller familier af gigantiske vira. Reteno et al. Formået at vælge andre protozoer som celle værter, der aldrig tidligere har været anvendt, og isolerede den nye Asfar-relaterede afstamning af gigantiske virus (den nyligt navngivne Faustovirus). 19
I et forsøg på at isolere nye Faustovirus genotyper for at udvide medlemmerne af denne viral afstamning, vi ændrede vores isolation procedurer og brugte dem til at screene miljøprøver i stand til at høste nye Faustoviruses. Vi derefterbeskrev hele protokollen til at karakterisere de nye isolater. Vi vurderede Vermamoeba vermiformis, de mest almindelige fritlevende protist fundet i humane miljøer, 20-22 som allerede anvendes i isoleringen af den første Faustovirus prototype E12. 19 Denne protist er i øjeblikket stadig vært-specifik for Faustovirus. Vi vidste, at ingen af de kendte gigantiske vira var patogen for denne amøbe, fordi ingen forsøg på at dyrke andre gigantiske vira i vores laboratorium viste amøbe lysis eller viral vækst. Derfor mener vi, at V. vermiformis er den bedste og mest unikke celle støtte kendt for at isolere nye Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muligheden for, at Faustovirus kunne være det første medlem af en ny Megavirales familie tæt på ASFV blev først foreslået af Reteno et al., 19, men nogle forskelle kan stadig skelnes. Det ser uklart, om Faustovirus bør tilslutte sig Asfarviridae familien, eller om det i stedet skal danne en ny formodet viral familie. Dette spørgsmål vil kræve yderligere undersøgelser, især en mere omfattende karakterisering af dets morfologi, værtsspektrum, replikation cyklus og gen-repertoire. Flere Fau…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
