We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
विशाल वायरस के अलगाव, विषाणु विज्ञान के इस नए युग में बहुत रुचि है, खासकर के बाद से इन विशाल वायरस प्रोटिस्टों से संबंधित हैं। विशालकाय वायरस प्रोटिस्टों की कई प्रजातियों के लिए संभावित रोगजनक हो सकता है। वे Megavirales की हाल ही में वर्णित आदेश के हैं। नई वंश Faustovirus कि मल के नमूनों से पृथक किया गया है दूर से स्तनधारी रोगज़नक़ अफ्रीकी सूअर बुखार वायरस से संबंधित है। यह वायरस भी अपने amoebal मेजबान, Vermamoeba vermiformis, एक protist स्वास्थ्य देखभाल के पानी की व्यवस्था में आम के लिए विशिष्ट है। यह क्रम में अपने जीनोटाइप संग्रह विस्तार और इसके अखिल जीनोम का अध्ययन करने में नए Faustovirus जीनोटाइप को अलग-थलग जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हम आदेश अमीबा सह संस्कृति की बैक्टीरियल और फंगल संदूषण से बचने के लिए एंटीबायोटिक और रोधी संयोजनों के उपयोग में सुधार और वायरस गुणन पक्ष द्वारा अतिरिक्त उपभेदों के अलगाव के लिए नई रणनीति विकसित की है। हम यह भी एक नया starvatio कार्यान्वितn मध्यम वी बनाए रखने के लिए वायरस सह संस्कृति के लिए इष्टतम स्थितियों में vermiformis। अंत में, हम कोशिकाविकृतिजनक प्रभाव का पता लगाने के लिए प्रवाह cytometry बजाय सूक्ष्म अवलोकन, जो समय लेने वाली है इस्तेमाल किया। हम सीवेज नमूनों से दो वियोजन प्राप्त की, इस विधि की दक्षता साबित करने और इस तरह Faustoviruses के संग्रह को चौड़ा करने, बेहतर अपने वातावरण, मेजबान विशिष्टता और आनुवंशिक सामग्री को समझने के लिए।
विशाल वायरस, विशेष रूप से Megavirales आदेश के लोगों की खोज, पूरी तरह से कण आकार और जीनोम जटिलता के संदर्भ में वायरस की दुनिया बदल गई। वायरस पहले से छोटे संस्थाओं होने लगा रहे थे, और Mimivirus सभी नियमों को तोड़ने के लिए दिखाई दिया। 1 Metagenomic डेटा विशाल वायरस न केवल वातावरण में, 2-5 लेकिन मनुष्यों में भी की सर्वव्यापकता पता चलता है। 6 इसलिए, वहाँ अभी भी एक की जरूरत है एक बड़े पैमाने पर इन वायरस के लिए खोज करने के लिए। इन विशाल वायरस की विविधता दुनिया भर में न केवल जलीय वातावरण की एक किस्म है और उनके संबद्ध अवसादों के नमूने, 7-11, लेकिन यह भी मानव नमूनों 12,13 और पर्यावरण के नमूनों की एक किस्म स्क्रीनिंग के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 7.9 एकेंथामीबा polyphaga mimivirus था phagocytic प्रोटिस्टा, मुख्य रूप से एकेंथामीबा एसपीपी का उपयोग करते हुए सह-संस्कृति से अलग किया। 14-16 विशाल वायरस की एक पूरी संग्रह तब भी थेइस निर्दिष्ट protist मेजबान है, जो वैज्ञानिक समुदाय एकेंथामीबा एसपीपी के लिए अपने अनुसंधान और अलगाव की प्रक्रिया को प्रतिबंधित कर दिया से अलग किया। जाहिर है एक ही मेजबान प्रजातियों पर इस निर्भरता हुई है में वायरस का एक बड़ा अंश अनदेखी की जा रही है। तथ्य यह है कि विशाल वायरस, CroV, अत्यधिक गतिशील समुद्री प्रोटोजोआ कैफेटेरिया roenbergensis के साथ अलग किया गया था, 17,18 आदेश नई प्रजातियों या विशाल वायरस के परिवारों की खोज करने में प्रोटोजोआ की एक व्यापक रेंज का उपयोग करने की आवश्यकता को दर्शाता है। Reteno एट अल। जो पहले से इस्तेमाल नहीं किया गया था सेल मेजबान के रूप में अन्य प्रोटोजोआ का चयन करने में कामयाब रहे, और विशाल वायरस के नए Asfar से संबंधित वंश (नए नाम Faustovirus) को अलग किया। 19
आदेश में इस वायरल वंश के सदस्यों का विस्तार करने में नए Faustovirus जीनोटाइप को अलग-थलग करने की कोशिश में है, हम अपने अलगाव प्रक्रियाओं संशोधित और उन्हें इस्तेमाल किया पर्यावरण के नमूनों नई Faustoviruses कटाई करने में सक्षम स्क्रीन करने के लिए। फिर हमनई वियोजन को चिह्नित करने के लिए पूरे प्रोटोकॉल का वर्णन किया। हम Vermamoeba vermiformis, सबसे आम मुक्त रहने वाले protist मानव वातावरण में पाया गया है, जो पहले से ही 20-22 पहला प्रोटोटाइप Faustovirus E12। 19 यह protist वर्तमान में अभी भी मेजबानी विशेष Faustovirus के लिए है अलगाव में प्रयोग किया जाता है का आकलन किया। हम जानते थे कि नाम से जाना जाता विशाल वायरस से कोई भी इस अमीबा के लिए रोगजनक था, क्योंकि कोई प्रयास के अन्य विशाल वायरस विकसित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला अमीबा सेल या वायरल वृद्धि देखी गई। इस कारण से, हम मानते हैं कि वी vermiformis सबसे अच्छा और सबसे अनोखी सेल नई Faustoviruses को अलग-थलग करने के लिए जाना जाता है का समर्थन है।
संभावना Faustovirus एक नया Megavirales परिवार ASFV के करीब के पहले सदस्य हो सकता है कि पहले Reteno एट अल।, 19 से सुझाव दिया गया था, लेकिन कुछ मतभेद अभी भी प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यह स्पष्ट नहीं है कि क्या दिखाई देता ह?…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements to make.
LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
Plates | Cellstar | France | 655180 |
PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |