用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
巨大なウイルスの分離は、これらの巨大なウイルスが原生生物に関連している、特に以来、ウイルス学のこの新しい時代に大きな関心です。ジャイアントウイルスは、原生生物の多くの種のための潜在的に病原性であってもよいです。彼らはMegaviralesの最近記載された順序に属しています。下水試料から単離された新しい系統Faustovirusは、哺乳動物の病原体アフリカ豚コレラウイルスの遠縁です。このウイルスはまた、そのアメーバホスト、Vermamoeba vermiformis、ヘルスケア水システムにおける共通の原生生物に固有のものです。 その遺伝子型のコレクションを拡大し、その汎ゲノムを研究するために、新しいFaustovirus遺伝子型を単離することを継続することが重要です。我々は、アメーバの共培養の細菌および真菌の汚染を回避するために、抗生物質および抗真菌組み合わせの使用を改善し、ウイルス増殖を有利にすることによって、追加の株の単離のための新たな戦略を開発しました。我々はまた、新しいstarvatioを実装しましたV.を維持するために、n個のメディアウイルス共培養のための最適な条件でvermiformis。最後に、我々は、細胞変性効果を検出するために、時間がかかり、フローサイトメトリーではなく、顕微鏡観察を使用します。私たちは、より自分の環境、宿主特異性と遺伝的内容を理解するために、この方法の効率を証明するため、Faustovirusesのコレクションを広げ、下水試料から2つの単離を得ました。
Introduction
巨大なウイルスの発見、Megavirales順に属する特には、完全に粒子サイズおよびゲノムの複雑さの点でウイルスの世界を変えました。ウイルスは以前に小規模事業体であると考えられ、そしてミミウイルスは、すべてのルールを破るように見えた。1メタゲノムデータは、環境だけでなく、巨大なウイルスの普遍性を示唆して2-5でなく、ヒトで。6ので、必要性がまだあります大規模にこれらのウイルスを検索します。これらの巨大なウイルスの多様性は、世界的な水環境の多様性とそれに関連する堆積物だけでなくをサンプリングすることによって評価7-11だけでなく、ヒトサンプル12,13及び環境試料の様々なスクリーニングすることにより行った。7,9 アカントアメーバカブトムシ亜目のミミウイルスでした貪食原生生物を用いた共培養により単離され、主にアカントアメーバ属巨人ウイルスの14-16全体のコレクションはまた次いで科学界は、 アカントアメーバ属のための研究および単離手順を制限作られ、この指定された原生生物宿主から単離されました。明らかに、単一の宿主種で、この依存は見落とされているウイルスの大部分をもたらしました。巨大なウイルス、CroVは、非常に運動性の海洋原生動物カフェテリアroenbergensisで単離されたという事実は、17,18は、新しい系統または巨大ウイルスの家族を発見するために原生動物の広い範囲を使用する必要性を示しています。 Reteno らは以前に使用されていなかった細胞宿主として他の原生動物を選択するために管理され、巨大なウイルス（新しく名前を付けたFaustovirus）の新しいAsfar関連の系統を単離した。19
このウイルス系統のメンバーを拡大するために、新しいFaustovirus遺伝子型を分離する試みでは、我々は我々の単離手順を修正し、新しいFaustovirusesを収穫することが可能な環境サンプルをスクリーニングするためにそれらを使用しました。私たちはその後、新しい分離株を特徴づけるプロトコル全体を説明。我々はすでに最初のFaustovirusプロトタイプE12の単離に使用されているVermamoebaのvermiformis、人間の環境で見られる最も一般的な自由生活原生生物、20-22を評価した 。19この原生生物は、現在まだホスト固有Faustovirusためです。我々は、我々の研究室で他の巨大なウイルスを成長させるいかなる試みはアメーバ溶解またはウイルス増殖を示さなかったので知られている巨大なウイルスのいずれもが、このアメーバのために病原性ではなかったことを知っていました。このような理由から、私たちはそれを信じてV. vermiformisは新しいFaustovirusesを単離するために、既知の最良かつ最もユニークな細胞支持体です。
Protocol
Representative Results
Discussion
FaustovirusがASFVに近い新しいMegaviralesファミリーの最初のメンバーであるという可能性はまずReteno ら、19によって示唆されたが、いくつかの違いがまだ区別することができます。 Faustovirusがアスファウイルス科ファミリーに参加する必要があるかどうかではなく、新しい推定されるウイルスのファミリーを形成する必要があるかどうかは不明で表示されます。この問題はさらに?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
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