En rask strategi for isolering av nye Faustoviruses fra miljøprøver ved hjelp<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
Isolasjon av gigantiske virus er av stor interesse for denne nye æra av virologi, spesielt siden disse gigantiske virus er relatert til protister. Giant virus kan være potensielt patogene for mange arter av protister. De tilhører den nylig beskrevet orden Megavirales. Den nye linjen Faustovirus som er isolert fra kloakkprøver er fjernt beslektet til pattedyr patogenet afrikansk svinepest-virus. Dette viruset er også spesifikk for sin amoebal vert, Vermamoeba vermiformis, en protoktister vanlig i helsevesenet vannsystemer. Det er viktig å fortsette å isolere nye Faustovirus genotyper for å forstørre sin genotype innsamling og studere dens pan-genom. Vi har utviklet nye strategier for isolering av ytterligere stammer ved å forbedre bruken av antibiotika og antisopp-kombinasjoner for å unngå at bakterier og sopp forurensninger av amøbe ko-kultur og som favoriserer viruset multiplikasjon. Vi har også implementert en ny starvation medium for å opprettholde V. vermiformis i optimale forhold for virus co-kultur. Til slutt har vi brukt flowcytometri i stedet for mikroskopisk observasjon, noe som er tidkrevende, å detektere den cytopatogen effekt. Vi erholdt to isolater fra kloakkprøvene, noe som viser effektiviteten av denne fremgangsmåte, og således utvide samlingen av Faustoviruses, for bedre å forstå deres miljø, vertsspesifisitet og genetiske innhold.
Introduction
Oppdagelsen av store virus, spesielt de som tilhører den Megavirales orden, helt forandret verden av virus når det gjelder partikkelstørrelse og genom kompleksitet. Virus ble tidligere antatt å være små enheter, og Mimivirus syntes å bryte alle regler. 1 Metagenomic data antyder ubiquity av gigantiske virus ikke bare i miljøet, 2-5 men også hos mennesker. 6 Derfor er det fortsatt behov å søke etter disse virusene i stor skala. Mangfoldet av disse gigantiske virus ble vurdert ved prøvetaking ikke bare et utvalg av vannmiljøer og tilhørende sedimentene over hele verden, 7-11 men også ved screening en rekke humane prøver 12,13 og miljøprøver. 7,9 De Acanthamoeba polyphaga mimivirus var isoleres ved co-kultur ved hjelp phagocytic protister, primært Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling av gigantiske virus var da ogsåisolert fra dette spesifisert protoktister vert, noe som gjorde det vitenskapelige samfunn begrense sin forskning og isolasjon prosedyre for Acanthamoeba spp. Klart dette avhengighet av en enkelt vert art har resultert i at en stor fraksjon av virus blir oversett. Det faktum at den gigantiske virus, CroV, ble isolert med svært bevegelige marine protozoer Kafeteria roenbergensis, 17,18 demonstrerer behovet for å bruke et bredere spekter av protozoer for å oppdage nye linjer eller familier av gigantiske virus. Reteno et al. Greid å velge andre protozoer som celle verter som aldri tidligere hadde blitt brukt, og isolert den nye Asfar relaterte avstamning av gigantiske virus (den nylig kåret Faustovirus). 19
I et forsøk på å isolere nye Faustovirus genotyper for å utvide medlemmene av denne viral avstamning, endret vi våre isoleringsprosedyrer og brukte dem til å screene miljøprøver i stand til å høste nye Faustoviruses. Vi deretterbeskrev hele protokollen for å karakterisere de nye isolatene. Vi vurderte Vermamoeba vermiformis, den vanligste frittlevende protoktister funnet i menneskelige omgivelser, 20-22 som allerede brukes i isolering av den første Faustovirus prototype E12. 19 Dette protoktister er for tiden fortsatt vert spesifikke for Faustovirus. Vi visste at ingen av de kjente gigantiske virus var patogene for dette amøbe, fordi ingen forsøk på å vokse andre gigantiske virus i vårt laboratorium viste amøbe lyse eller viral vekst. Av denne grunn, tror vi at V. vermiformis er den beste og mest unike celle støtte kjent for å isolere nye Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muligheten for at Faustovirus kan være den første del av en ny familie Megavirales nær ASFV ble først foreslått av Reteno et al., 19 men noen forskjeller kan fremdeles skjelnes. Det synes uklart om Faustovirus bør bli medlem av Asfarviridae familien eller om det bør i stedet danne en ny antatt viral familien. Dette problemet vil kreve ytterligere undersøkelser, spesielt en mer omfattende karakterisering av dens morfologi, vertsområde, replikasjonssyklus og genet repertoar. Flere Faustovirus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
