Быстрой стратегия для выделения новых Faustoviruses из проб окружающей среды Использование<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
Выделение гигантских вирусов представляет большой интерес в этой новой эры вирусологии, тем более, что эти гигантские вирусы связаны с простейшими. Гигантские вирусы могут быть потенциально патогенными для многих видов протистов. Они принадлежат к недавно описанному порядку Megavirales. Новая линия Faustovirus, который был выделен из проб сточных вод является отдаленное отношение к возбудителю млекопитающих африканской чумы свиней вирусом. Этот вирус также специфическими для его amoebal хозяина, Vermamoeba vermiformis, в протисты распространены в системах здравоохранения воды. Крайне важно, чтобы продолжить выделения новых генотипов Faustovirus для того, чтобы расширить свою коллекцию генотип и изучения ее пан-геном. Мы разработали новые стратегии для выделения дополнительных штаммов путем улучшения использования антибиотиков и противогрибковых комбинаций, чтобы избежать бактериальных и грибковых загрязнений амебы сокультивирования и пользу размножение вируса. Мы также реализовали новую starvatioп среда для поддержания V. vermiformis в оптимальных условиях на наличие вирусов сокультивирования. Наконец, мы использовали поточной цитометрии, а не Микроскопическое наблюдение показало, что занимает много времени отнимает много, чтобы обнаружить цитопатогенный эффект. Мы получили два изолятов из проб сточных вод, доказывая эффективность этого метода и таким образом расширяя коллекцию Faustoviruses, чтобы лучше понять их окружение, хозяина и специфичность генетического содержания.
Introduction
Открытие гигантских вирусов, особенно те, которые принадлежат к порядку Megavirales, полностью изменили мир вирусов с точки зрения размера частиц и сложности генома. Вирусы были ранее считались малые предприятия, а мимивирус явился нарушить все правила. 1 метагеномной данные свидетельствуют о вездесущность гигантских вирусов не только в среде, 2-5 , но и в организме человека. 6 Таким образом, все еще существует необходимость для поиска этих вирусов в больших масштабах. Разнообразие этих гигантских вирусов оценивали путем отбора проб не только разнообразие водной среды и связанных с ними отложений по всему миру, 7-11 , но и путем скрининга различных человеческих образцов 12,13 и проб окружающей среды. В 7,9 Polyphaga мимивирус Acanthamoeba было изолированы путем совместной культуры с помощью фагоцитоза простейших, в первую очередь Acanthamoeba SPP. 14-16 вся коллекция гигантских вирусов были тогда такжеизолированы от этого указанного протисты хозяина, который сделал научное сообщество ограничить свою исследовательскую и изолированности процедуру Acanthamoeba SPP. Ясно, что эта зависимость от одного вида хозяина привела большая часть вирусов не замечают. Тот факт , что гигантский вирус, CroV, был выделен с высоко мотильных морских простейшими кафетерия roenbergensis, 17,18 демонстрирует необходимость использования более широкого спектра простейшими для того , чтобы открыть новые клоны или семейства гигантских вирусов. Reteno и др. Удалось выбрать другой простейшими в качестве клетки хозяев , которые никогда ранее не были использованы, и выделили новый Asfar связанную происхождение гигантских вирусов (недавно названный Faustovirus). 19
В попытке выделить новые генотипы Faustovirus с целью расширения членов этого вирусного происхождения, мы изменили наши процедуры изоляции и использовали их для скрининга проб окружающей среды, способных уборки новых Faustoviruses. Мы тогдаописал весь протокол для характеристики новых изолятов. Мы оценивали Vermamoeba vermiformis, наиболее распространенный свободно живущих протисты обнаружены в человеческих условиях, 20-22 , которая уже используется в изоляции первого Faustovirus прототипа E12. 19 Этот протисты в настоящее время до сих пор у себя специфичные для Faustovirus. Мы знали, что ни один из известных вирусов гигантских был патогенным для этого амебы, потому что никакие попытки не выращивать другие вирусы гигантские в нашей лаборатории показали, амебы лизиса или вирусный рост. По этой причине мы считаем , что В. vermiformis является лучшим и самым уникальным поддержка клеток известно, выделить новые Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность того, что Faustovirus может быть первым членом нового семейства Megavirales близко к АЧС была впервые предложена Reteno и др., 19 , но некоторые различия все еще можно отличить. Оказывается, неясно, следует ли Faustovirus присоединиться к семье Asfarviridae или должен ли он вместо того, чт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
