En snabb strategi för isolering av nya Faustoviruses från miljöprover Använda<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
Isoleringen av jätte virus är av stort intresse i denna nya era av virologi, särskilt eftersom dessa gigantiska virus är relaterade till protister. Giant virus kan vara potentiellt patogena för många arter av protister. De tillhör den nyligen beskrivna ordning Megavirales. Den nya linjen Faustovirus som har isolerats från avloppsprov är en avlägsen släkting till däggdjurs patogen afrikansk svinpest-virus. Detta virus är också specifik för sin amoebal värd, Vermamoeba vermiformis, en protist vanligt i hälso- och sjukvårds vattensystem. Det är viktigt att fortsätta att isolera nya Faustovirus genotyper för att förstora sin genotyp insamling och studera dess pan-genomet. Vi utvecklade nya strategier för isolering av ytterligare påfrestningar genom att förbättra användningen av antibiotika och svampdödande kombinationer för att undvika bakterie- och svampkontaminering av amöba co-kultur och gynnar virusförökning. Vi genomförde också en ny starvation medium för att upprätthålla V. vermiformis i optimala förhållanden för virus co-kultur. Slutligen använde vi flödescytometri snarare än mikroskopisk observation, vilket är tidskrävande, att detektera den cytopatogena effekten. Vi fick två isolat från avloppsprov, bevisar effektiviteten i denna metod och på så sätt bredda samling Faustoviruses, för att bättre förstå sin omgivning, värdspecificitet och genetiska innehåll.
Introduction
Upptäckten av jätte virus, i synnerhet de som hör till den Megavirales ordning, helt förändrade världen av virus i termer av partikelstorlek och genomet komplexitet. Virus tidigare tros vara små enheter, och Mimivirus verkade bryta alla regler. 1 metagenomic data antyder den gränslösa jätte virus inte bara i miljön, 2-5 men även hos människor. 6 Därför finns det fortfarande ett behov för att söka efter dessa virus i stor skala. Mångfalden av dessa gigantiska virus bedömdes genom provtagning inte bara en mängd olika vattenmiljöer och tillhörande sediment i världen, 7-11 men också genom att screena ett flertal humana prover 12,13 och miljöprover. 7,9 De Acanthamoeba allätarbaggar Mimivirus var isolerades genom samodling med hjälp av fagocytiska protists främst Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling av gigantiska virus var då ocksåisolerad från den angivna protist värd, vilket gjorde det vetenskapliga samfundet begränsa dess förfarande för Acanthamoeba spp forskning och isolering. Självklart är detta beroende av en enda värdarter har resulterat i en stor del av virus förbises. Det faktum att den gigantiska virus, CroV, isolerades med den mycket rörliga marina protozoer Cafeteria roenbergensis, 17,18 visar behovet av att använda ett bredare spektrum av protozoer i syfte att upptäcka nya linjer eller familjer av gigantiska virus. Reteno et al. Lyckades välja andra protozoer som cellvärdar som aldrig tidigare använts, och isolerade den nya Asfar relaterade härstamning jätte virus (det nya namnet Faustovirus). 19
I ett försök att isolera nya Faustovirus genotyper för att expandera medlemmarna i denna virus härstamning, ändrade vi våra isoleringsförfaranden och använde dem för att screena miljöprover kan skörda nya Faustoviruses. Vi dåbeskrev hela protokollet för att karaktärisera de nya isolaten. Vi bedömde Vermamoeba vermiformis, den vanligaste fritt levande protist återfinns i humana miljöer, 20-22 som redan används i isoleringen av den första Faustovirus prototypen E12. 19 Denna protist är för närvarande fortfarande värd-specifik för Faustovirus. Vi visste att ingen av de kända jätte virus var patogena för amöba, eftersom inga försök att odla andra jätte virus i vårt labb visade amöba lys eller viral tillväxt. Av den anledningen anser vi att V. vermiformis är den bästa och mest unika cell stöd känd för att isolera nya Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Möjligheten att Faustovirus kan vara den första medlemmen i en ny Megavirales familj nära ASFV föreslogs först av Reteno et al., 19 men vissa skillnader kan fortfarande urskiljas. Det verkar oklart om Faustovirus bör ansluta sig till Asfarviridae familjen eller om det istället bör utgöra en ny förmodad viral familj. Denna fråga kommer att kräva ytterligare utredning, framför allt en mer omfattande karakterisering av sin morfologi, värdområde, replikationscykeln och gen repertoar. Mer F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
