उम्र बढ़ने के मानव रोगों में फंसा जीन का अध्ययन किया आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए एक phenotyping आहार
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
उम्र से जुड़े रोगों के आधुनिक समाज में तेजी से प्रचलित हो रहे हैं। चिकित्सा विज्ञान में सुधार और जीवन प्रत्याशा बढ़ जाती है, जनसंख्या उम्र के लिए जारी है और इन रोगों के बोझ बढ़ता है। प्रभावी उपचार दुर्बल करने वाली स्थितियों के प्रभाव को कम करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन कई मामलों में मायावी रहते हैं। केवल कारणों और उम्र बढ़ने के साथ जुड़े रोगों की विकृति को समझने के द्वारा वैज्ञानिकों के हस्तक्षेप के लिए संभावित ठिकानों चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने और विकसित करने के लिए शुरू कर सकते हैं। आम उम्र से संबंधित स्थिति ऐसी पार्किंसंस रोग (पीडी) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) के रूप में neurodegenerative विकारों में शामिल हैं। पीडी सबसे आम आंदोलन मनुष्यों में neurodegeneration की वजह से विकार है। अधिकांश रोगियों पीडी इस तरह के उम्र के 50 साल के बाद कंपन, bradykinesia और कठोरता आराम कर रही है जैसे लक्षण दिखाई देते हैं। प्रारंभिक शुरुआत भी मामलों का लगभग 10% में देखा गया है।
एएमडी में अंधापन का प्रमुख कारण हैबुजुर्ग, उत्तरोत्तर हानिकारक फोटोरिसेप्टर और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) आंखों में। केंद्रीय दृष्टि बिगड़ा हुआ है लेकिन परिधीय दृष्टि आम तौर पर अप्रभावित है। वहाँ एएमडी के दो रूप हैं। "सूखी" के रूप में, बाह्य प्रोटीन RPE और Bruch झिल्ली (बीएम) के बीच drusen फार्म के रूप में जाना जाता जमा, भौगोलिक शोष के प्रमुख और केंद्रीय दृष्टि धुंधला। अधिक गंभीर "गीले" प्रपत्र neovascularization से बी.एम. भर रंजित RPE और फोटोरिसेप्टर परतों में से परिणाम और रेटिना कि रेटिना के ऊतकों को स्थायी नुकसान का कारण बनता नीचे hamorrhaging करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गुणसूत्र 1 और 10q26 ठिकाना, जहां उम्र से संबंधित maculopathy संवेदनशीलता 2 (ARMS2) और पूरक कारक एच (CFH): जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन पहले से लोकी है कि इस रोग की वृद्धि हुई संवेदनशीलता के साथ जुड़ा हुआ है और ब्याज के दो क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं की पहचान की है उच्च तापमान की आवश्यकता कारक A1 (HtrA1) जीन 1-5 स्थित हैं </sup>। इन alleles के युग्म एक खुराक निर्भर तरीके से एएमडी की संभावना को बढ़ाने के लिए और विशिष्ट SNPs रियायत के एएमडी 3-6 की या तो गीला या सूखी रूपों के साथ जुड़ा हो सकता है।
CFH सी 3 की सक्रियता के द्वारा बाधा पूरक प्रणाली के वैकल्पिक मार्ग (एपी) की एक नकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है। एक एकल nucleotide बहुरूपता (एसएनपी) सी प्रतिस्थापन 1 करने के लिए एक टी के कारण एएमडी का खतरा बढ़ से जोड़ा गया है, हिस्टिडीन साथ एक्सॉन 9 में tyrosine 402 के आदान-प्रदान के कारण। एएमडी में यह माना जाता है कि एपी CFH के समारोह का एक नुकसान की वजह से है, लेकिन है कि क्या एसएनपी निभाता है एक कारण भूमिका स्पष्ट नहीं है misregulated है। एक परिकल्पना है कि सकारात्मक आरोप लगाया हिस्टिडीन प्रोटीन सी-रिएक्टिव प्रोटीन बातचीत और हेपरिन सल्फेट 1,7 के लिए बाध्य करने CFH की क्षमता को नकारना सोचा जाता है। CFH में Y402H की इन विट्रो अध्ययन वेरिएंट के बीच कार्यात्मक मतभेदों पर परस्पर विरोधी परिणाम प्रदान करते हैं और में में काम vivo में <उन्हें> CFH – / – चूहों व्यक्त humanized CFH चल रहे 8 है। ARMS2, रहनुमा जीनोम में HtrA1 के ऊपर स्थित है, हालांकि जीन चूहों में अनुपस्थित है। HtrA1 एक सेरीन प्रोटीज है लेकिन ARMS2 खराब होती है। एएमडी जुड़े लोकस में SNPs के बीच संबंध असंतुलन यह मुश्किल इस क्षेत्र में जीन के म्यूटेशन व्यक्ति के जोखिम के लिए योगदान निर्धारित करने के लिए बनाया गया है, लेकिन हाल ही में काम सुझाव दिया है कि यह नहीं बल्कि ARMS2 से HtrA1 की overexpression कि neovascularization की ओर जाता है और subretinal प्रोटीन जमा 9-11। हालांकि, इस लोकस में जीन के करीब निकटता बातचीत है कि बेतरतीब ढंग से डाला transgenes का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता लिए अनुमति दे सकता।
एएमडी के अलावा, सेरीन proteases की HtrA परिवार के कई मानव रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। सभी HtrA प्रोटीन एक सेरीन प्रोटीज डोमेन कम से कम एक सी टर्मिनल PDZ डोमेन के बाद होते हैं। HtrA1, HtrA3 और HtrA4 जीआर हिस्साeatest अनुरूपता, एक संकेत पेप्टाइड, इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक बाध्यकारी डोमेन, एक Kazal protease अवरोध डोमेन, सेरीन प्रोटीज डोमेन और एक PDZ डोमेन से मिलकर। HtrA2 एक अलग एन टर्मिनस, एक mitochondrial स्थानीयकरण अनुक्रम, transmembrane डोमेन से बना है और apoptosis बाध्यकारी डोमेन के अवरोध प्रोटीज और PDZ डोमेन 12-16 द्वारा पीछा किया। स्तनधारी HtrA1 अपनी प्रोटीज डोमेन 17-20 के सक्रिय साइट में सब्सट्रेट प्रेरित remodeling द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और HtrA2 भी सेरीन प्रोटीज और PDZ डोमेन है कि प्रोटीज गतिविधि 21 को दबा के बीच बातचीत के द्वारा ठीक किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है PDZ डोमेन HtrA3 16 के समान विनियमन प्रदान करने के लिए प्रकट नहीं होता है। HtrA proteases भी बाह्य कारकों से नियंत्रित किया जा सकता: यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है वहाँ HtrA1 के बीच एक नियामक बातचीत मौजूद है और 22 protoporphyrins और HtrA2 p38 एमएपी काइनेज के सक्रियण पर फोस्फोराइलेशन द्वारा विनियमित किया जा सकता हैएक PINK1 निर्भर तरीके 23 में मार्ग। चूहों में HtrA परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों का विलोपन दर्ज किया गया है, हालांकि यंत्रवत प्रभाव ज्यादातर आंशिक रूप से दिखाई दे रहा phenotypes की कमी के कारण स्पष्ट नहीं कर रहे हैं।
HtrA1 प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण कार्य खेलता है और इसकी misregulation या उत्परिवर्तन गठिया, कैंसर और एएमडी 3,4,24-32 का खतरा बढ़ सहित कई अलग अलग मानव रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। तंत्रिका ऊतकों में HtrA2 समारोह की हानि, मनुष्यों और चूहों में पीडी phenotypes के साथ संबद्ध किया गया है, जबकि त्वरित में गैर तंत्रिका ऊतकों परिणामों से इसके नुकसान उम्र बढ़ने 33-37। HtrA3 अनियंत्रण प्रीक्लेम्पसिया और कैंसर 38,39 के कुछ प्रकार के सहित रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। अप-विनियमन HtrA4 की प्रीक्लेम्पसिया रोगियों लेकिन पीटा चूहों की गर्भनालों में देखा गया है एक खुला phenotype 40,41 प्रदर्शित नहीं करते। कुछ पीटा चूहों में मनाया phenotypes की कमी की गई हैHtrA परिवार के किसी सदस्य के बीच मुआवजे का एक परिणाम होने की माने: यह सोचा है कि दोनों HtrA4 और HtrA1 प्रोटीन के TGF-बी परिवार के साथ बातचीत, HtrA4 41 का विलोपन पर HtrA1 द्वारा मुआवजे के लिए अनुमति देता है। इसी तरह, यह सोचा है कि वे पूरक कार्यों 42 हो सकता है कि जब से HtrA1 और HtrA3 डोमेन homologies के एक उच्च डिग्री है। हालांकि, यह सुझाव दिया गया है HtrA प्रोटीन आंशिक रूप से विरोधी भूमिकाओं हो सकता है, आम लक्ष्य 43 विनियमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा।
आगे इन जोखिम कारकों की जांच करने के लिए तीन humanized दस्तक माउस लाइनों उत्पन्न किया गया। CFH TM1 में (CFH * 9) jhoh और CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, CFH जीन की एक्सॉन 9 CFH TM1 मानव सजात की एक्सॉन 9 से बदला है। (CFH * 9) jhoh गैर रोग जुड़े tyrosine encodes स्थिति 402 पर छाछ, जबकि CFH TM2 (CFH * 9) jhoh Y402H, जोखिम जुड़े एसएनपी किया जाता है। मेंमानव ARMS2 अनुक्रम tm1jhoh ARMS2 एक क्षेत्र HtrA1 के अपस्ट्रीम को निशाना बनाया गया था। एक loxP-घिरे रोकें अनुक्रम जीन अनुक्रम लेकिन शामिल UbiC प्रमोटर के बहाव के ऊपर रखा OzCre चूहों, जो Rosa26 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Cre recombinase व्यक्त करते हैं, जैसा कि पहले 34 में वर्णित को पार करके अलग किया गया। के अलावा इन दस्तक लाइनों, CFH और HtrA1 (CFH tm1jhoh और HtrA1 tm1jhoh), साथ ही दूसरे को जानते HtrA परिवार के सदस्यों के लिए सशर्त पीटकर alleles उत्पन्न किया गया: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) और HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh)। एक्सॉन 3, HtrA1; रोगाणु लाइन नॉकआउट loxP साइटों, जैसे कि विलोपन एक फ्रेम पारी और / या सक्रिय डोमेन (CFH का विलोपन का कारण बनता है के साथ विशिष्ट एक्सॉनों पार्श्व करने के लिए इंजीनियर जानवरों के लिए OzCre चूहों पार करके बनाया गया था एक्सॉनों 2-3, HtrA2: एक्सॉनों 2-4, HtrA3; एक्सॉन 3, HtrA4; एक्सॉनों 4-6) 34,41। HtrA2 के एक तंत्रिका विलोपन, Nestin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Cre recombinase का उपयोग कर नष्ट कर दिया (HtrA2 Flox, टीजी (एनईएस-सीआरई) 1Kln / जम्मू), भी 34 में वर्णित किया गया है। केवल HtrA2 कमी चूहों, या तो प्रणालीबद्ध या तंत्रिका ऊतकों में, स्पष्ट phenotypes प्रदर्शित, Parkinsonian phenotypes के साथ पेश किया।
चूंकि ब्याज की इन जीनों में से कुछ के माइटोकॉन्ड्रिया 11,44-47 के लिए स्थानीय किए जाने की मंजूर किया जाता है, और HtrA2 का विलोपन Parkinsonian phenotypes, एक mitochondrial और तंत्रिका संबंधी ध्यान देने के साथ एक phenotyping आहार यहाँ वर्णित है और ब्याज के परीक्षण से प्रतिनिधि परिणाम प्रदान की जाती हैं उत्पन्न । आदेश, अनुवांशिक इंजीनियर को अच्छी तरह से मानव, उम्र से संबंधित रोग जांच करने के लिए और व्यवस्थित ढंग से एक प्रारंभिक phenotyping अनुसूची स्थापित किया गया था उत्पादित चूहों की जांच के लिए दो मुख्य से संबंधित परीक्षणों की एक श्रृंखला से मिलकर मेंब्याज की बीमारियों: एएमडी और पार्किंसंस।
Protocol
Representative Results
Discussion
मजबूत उपचार मानव उम्र बढ़ने से संबंधित शर्तों दुर्बल के प्रभाव को सीमित करने की जरूरत है, लेकिन वे कई स्थितियों के लिए मायावी रहते हैं। संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और हस्तक्षेप के लिए रणनीति ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के लिए अनुदान Rosebay मेडिकल फाउंडेशन और एक येल मेडिकल स्कूल के डीन रिसर्च फंड (झा) से आया है। हम व्यवहार प्रयोगों के साथ मदद के लिए डॉ क्लेयर कोएनिग धन्यवाद। अनुवांशिक इंजीनियर माउस लाइनों Ozgene (पर्थ, ऑस्ट्रेलिया) में उत्पन्न हुए थे।
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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