ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出
Summary
このプロトコルは、カスタムメイドのポータブルFRET分析器を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサデータの迅速かつ高感度定量を記載しています。デバイスは、糖度の実用的かつ効率的な評価を可能にする、検出感度を最大臨界温度範囲にマルトースを検出するために使用しました。
Abstract
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサにおける最近の改善は、イオンおよびアミノ酸を含む種々の小分子を検出するためのそれらの使用を有効にしています。しかしながら、FRETセンサーの生来の弱い信号強度を様々な分野での応用を防止し、高価な、ハイエンドの使用が必要な蛍光光度計になり大きな課題です。以前、我々は、特に、高い検出感度を達成するために、2つの発光波長帯域（530および480 nm）との比を測定することができる費用対効果の高い、高性能なFRET分析器を内蔵しました。 55゜C – 最近では、それは、細菌ペリプラズム結合タンパク質とのFRETセンサー50の臨界温度範囲で最大感度を有するリガンドを検出することが発見されました。このレポートは、温度固有のFRETセンサーと当社のポータブルFRET分析装置を用いて、市販の飲料試料中の糖含量を評価するためのプロトコルについて説明します。我々の結果は、追加予熱することを示しましたFRETセンサーのプロセスが大幅糖含有量のより正確な測定を可能にするために、FRET比の信号を増大させます。カスタムメイドのFRET分析器及びセンサが正常に商業飲料3種類の糖含有量を定量化するために適用しました。我々はさらに小型化や機器の性能向上は、ハイエンドの機器が利用できない環境で手持ち分析装置の使用を容易にするであろうことを期待しています。
Introduction
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、糖、カルシウムイオン、およびアミノ酸1-4のような小分子を検出するための生体センサとして使用されてきました。 FRETバイオセンサーは、ペリプラズム結合タンパク質（のPBP）の両末端に融合される蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（CFPS）、および黄色蛍光タンパク質（YFPs）を含みます。糖は、その後のPBPの両端にある2つの蛍光タンパク質の距離と遷移双極子の向きを変化させるセンサに構造変化を引き起こし、FRETセンサーの中央に位置するのPBPに結合します。この変更は、EYFP（530 nm）をECFP（480 nm）での発光波長の比を測定することにより、糖度の定量分析を可能にします。高い感度、特異性、リアルタイムの監視能力、及びFRETバイオセンサーの速い応答時間のために、これらのセンサが広く、環境産業、および医療用途5で使用されています。また、ratiomセンサー濃度を容易に制御することができず、バックグラウンド蛍光が常に存在する複雑な生物学的試料中の成分を測定するために使用することができるようにFRETバイオセンサーを用いてetric測定は、重要な実用上の利点を有しています。
定量的な可視化のためのFRETベースのセンサのこれらの利点にもかかわらず、蛍光タンパク質の不完全なドメイン動き転送に小さな構造的変化は、本質的に弱い信号強度を生成します。この弱い信号は、 インビトロまたはインビボ分析 6 に FRETベースのセンサの適用を制限します。その結果、ほとんどのFRETバイオセンサーは高価で高感度な装置の使用を必要とします。以前、我々は、既存の蛍光分析装置7と同様の機能を備えた安価なポータブルFRET分析装置を開発しました。この装置では、安価な405 nmの帯域紫外発光ダイオード（LED）は、目の励振を引き起こすために、光源として使用されました電子蛍光シグナル、高価なランプまたはレーザーを置き換えます。分析装置の検出システムは、効率的にシリコンフォトダイオードを有する2つの光検出器上に放熱蛍光信号を集束させます。 55°C大幅レシオメトリックFRETシグナル8を拡大できた-より最近の研究では、50の検出温度の最適化があることを示しました。この温度固有のシグナル増強は、カスタムメイドのFRETアナライザと一緒に、迅速かつ高感度で、より一般的な診断用途でのFRETセンサーの使用を可能にします。
このプロトコルでは、我々は、商業的に入手可能な飲料の糖含有量を定量することにより、最適なFRET温度条件下FRET解析の一般的な適用可能性を実証しました。このプロトコルは、FRETデバイス動作の詳細、ならびにセンサーおよび試料調製の簡単な説明を提供します。我々は、この報告書は、ポータブルの潜在的な適用を促進することを期待します小規模な実験室環境でのアナライザとFRETベースのバイオセンサーと安価なオンサイト診断装置のさらなる発展のための基盤を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、FRETセンサーのための最適な温度でカスタムメイドのFRET解析装置7を使用して、飲料試料中の糖含量の迅速かつ効率的な定量化を可能にします。分析器は、光源とシリコンフォトダイオードと2つの光検出器として最近開発された、安価な405-nm帯の紫外LEDで設計されました。このデバイスは、より費用対効果の他の同等の蛍光光度計よりなります。デバイスは、特にF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、グローバルフロンティアプロジェクト（2011から0031944）とKRIBB研究イニシアティブプログラムのインテリジェント合成生物学センターからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
