高度敏感和快速荧光检测用便携式分析仪FRET
Summary
这个协议描述了使用定制便携式FRET分析器荧光共振能量转移（FRET）的传感器数据的快速且高灵敏度定量。该装置被用于最大化的检测灵敏度，有利的糖含量的实际和有效的评估的临界温度范围内检测麦芽糖。
Abstract
在荧光共振能量转移最近的改进（FRET）传感器已经使它们的使用，以检测各种小分子，包括离子和氨基酸。然而，FRET传感器的先天弱信号强度，以防止在各个领域的应用并使得使用昂贵的，高端的荧光计必要的一个重大挑战。先前，我们构建可以特异性测量两个发射波长带（530和480纳米）的比率，以实现高的检测灵敏度具有成本效益的，高性能的FRET分析仪。最近，人们发现FRET传感器与细菌周质结合蛋白检测用在临界温度范围的50最高灵敏度的配体 – 55℃。这份报告描述了使用我们的便携式FRET分析仪具有特定的温度-FRET传感器市售饮料样品评估中含糖量的协议。我们的结果表明，附加的预热FRET的传感器的过程显著增加的FRET比率信号，以使糖含量更精确的测量。定做的FRET分析仪和传感器成功地应用到量化糖含量在三种类型的商业饮料。我们预计，设备的尺寸进一步降低和性能的提高将有利于环境中使用手持式分析仪，其中高端装备不可用。
Introduction
荧光共振能量转移（FRET）已被广泛地用作生物统计传感器来检测小分子如糖，钙离子，氨基酸1-4。 FRET生物传感器含有荧光蛋白，青色荧光蛋白（国家重点计划）和黄色荧光蛋白（YFPs），其稠合到周质结合蛋白（的PBPs）的两端。糖类结合到位于FRET传感器的中间的PBPs，从而导致其随后改变在的PBPs的一端的两个荧光蛋白的距离和跃迁偶极取向传感器的结构变化。这种改变，通过测量EYFP（530纳米），ECFP（480纳米）的发光波长的比率使得能够糖含量的定量分析。由于高灵敏度，特异性，实时监测能力，和FRET生物传感器的响应时间快，这些传感器被广泛应用于环境，工业和医疗应用5。此外，比率式使用FRET生物传感器etric测量具有重要的实际的好处，因为它可以用来测量复杂生物样品，其中所述传感器的浓度不能被容易地控制和背景荧光总是存在于组件。
尽管基于FRET的传感器，用于定量可视化的这些优点，不完整的域名运动转移到荧光蛋白微小的结构性变化产生固有的弱信号强度。这个弱信号限制基于FRET的传感器，用于在体外或体内分析6的应用程序。因此，大多数FRET生物传感器需要使用昂贵的，高度敏感的设备。先前，我们开发了一种廉价和便携式FRET分析仪类似于现有荧光分析仪7的功能。在该装置中，廉价的405纳米波段紫外发光二极管（LED）作为光源，使第激发Ë荧光信号，更换昂贵的灯泡或激光。分析仪的检测系统的散热荧光信号高效率地聚焦到两个光电检测器与硅光电二极管。在最近的研究中，我们发现，在50检测温度的优化- 55°C可能显著放大比例FRET信号8。这个特定的温度信号增强，与定做的FRET分析仪一起使得能够快速且高灵敏度更一般诊断应用中的使用的FRET传感器。
在这个协议中，我们通过量化市售饮料的糖含量表现出最佳的FRET的温度条件下的FRET分析仪的通用性。这个协议提供了FRET设备操作的细节，以及传感器和样品制备的简要说明。我们预计，该报告将推动便携式的潜在应用分析器在小规模的实验室环境，并提供与基于FRET的生物传感器的廉价的现场诊断装置的进一步发展奠定了基础。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议允许饮料样品中的糖含量的快速和有效的量化，使用定做的FRET分析器7在用于FRET传感器的最佳温度。分析器被设计用最近开发的，廉价的405纳米波段紫外LED作为光源和两个光检测器与硅光电二极管。这个装置是更符合成本效益比其它可比的荧光计。该器件显示高检测灵敏度，在最佳的温度范围为FRET传感器测量两个发射波长带（530纳米和480纳米）的比率特别时。它的灵敏度和强度检?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由赠款全球前沿项目（2011-0031944）和KRIBB研究计划项目的智能合成生物学中心的支持。
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
