Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.
Abstract
Die jüngsten Verbesserungen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Sensoren haben ihre Verwendung aktiviert werden, damit verschiedene kleine Moleküle einschließlich Ionen und Aminosäuren erkennen. Allerdings ist die angeborene schwache Signalintensität von FRET-Sensoren eine große Herausforderung dar, die ihre Anwendung in verschiedenen Bereichen verhindert und die Verwendung von teuren High-End-Fluorometer notwendig. Bisher haben wir eine kostengünstige, High-Performance-FRET-Analyzer, der speziell das Verhältnis von zwei Emissionswellenlängenbändern zu messen (530 und 480 nm) hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. In jüngerer Zeit wurde entdeckt, dass FRET Sensoren mit bakteriellen periplasmatischen Bindungsproteinen Liganden mit einer maximalen Empfindlichkeit im kritischen Temperaturbereich von 50 erfassen – 55 ° C. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll Zuckergehalt in handelsüblichen Getränkeproben unter Verwendung unserer tragbaren FRET-Analysator mit einer temperaturspezifischen FRET-Sensor für die Beurteilung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die zusätzliche VorwärmungProzess des FRET-Sensor erhöht die FRET-Verhältnissignal, eine genauere Messung des Zuckergehalts zu ermöglichen. Maßgeschneiderte FRET-Analysator und Sensor wurden erfolgreich den Zuckergehalt in drei Arten von kommerziellen Getränke zu quantifizieren angewandt. Wir gehen davon aus, dass eine weitere Größenreduktion und Leistungssteigerung der Anlage wird die Verwendung von Hand Analysatoren in Umgebungen erleichtern, in denen High-End-Geräte nicht zur Verfügung steht.
Introduction
Förster – Resonanzenergietransfer (FRET) wurde als biometrischer Sensor zur Erkennung kleiner Moleküle wie Zucker, Calciumionen und Aminosäuren 1-4 verwendet. FRET Biosensoren enthalten fluoreszierende Proteine, cyan fluoreszierende Proteine (CFPs) und Gelb fluoreszierendes Protein (YFPs), die an beiden Enden des periplasmatischen-bindenden Proteinen fusioniert sind (PBPs). Zucker binden an PBPs in der Mitte des FRET-Sensor befindet, strukturelle Änderungen an dem Sensor verursachen, die anschließend den Abstand und Übergangsdipolmomente Orientierung der beiden fluoreszierenden Proteinen an jedem Ende des PBP verändern. Diese Änderung ermöglicht die quantitative Analyse der Zuckergehalt, indem das Verhältnis der Emissionswellenlängen von EYFP (530 nm) und ECFP (480 nm) gemessen wird. Aufgrund der hohen Sensitivität, Spezifität, Echtzeit – Monitoring – Kapazitäten und eine schnelle Reaktionszeit von FRET Biosensoren sind diese Sensoren weit verbreitet in der Umwelt, Industrie und medizinische Anwendungen 5. Außerdem ratiometric Messung mittels FRET Biosensoren hat wichtige praktische Vorteile, da es verwendet werden kann, Komponenten in komplexen biologischen Proben zu messen, wo der Sensor-Konzentration nicht leicht gesteuert werden kann und die Hintergrundfluoreszenz ist immer vorhanden.
Trotz dieser Vorteile von FRET-basierten Sensoren für quantitative Visualisierung, kleine strukturelle Veränderungen mit unvollständigen Domain Bewegungsübertragung auf die fluoreszierenden Proteine produzieren von Natur aus schwach Signalintensität. Dieses schwache Signal begrenzt die Anwendung von FRET-basierten Sensoren für die in vitro oder in vivo – Analyse 6. Folglich meisten FRET Biosensoren die Verwendung von teuren und hochempfindliche Ausrüstung erfordern. Bisher haben wir eine kostengünstige und portable FRET – Analysator mit Funktionen ähnlich denen der bestehenden Fluoreszenz Analysatoren 7. Bei dieser Vorrichtung ist kostengünstig 405-nm-Band ultraviolettem Licht emittierende Diode (LED) als Lichtquelle verwendet Anregung th zu verursachene Fluoreszenzsignal, eine teure Lampe oder einem Laser zu ersetzen. Das Detektionssystem des Analysators fokussiert effizient das ableitende Fluoreszenzsignal auf zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. In einer neueren Studie wurde gezeigt, dass die Optimierung der Erfassungstemperatur bei 50 – 55 ° C signifikant die ratiometrisch FRET – Signal 8 vergrößern könnte. Diese Temperatur spezifische Signalverstärkung, zusammen mit dem maßgeschneiderten FRET-Analyzer, ermöglicht die Verwendung von FRET-Sensoren in allgemeinere diagnostische Anwendungen mit schnellen und hohen Empfindlichkeit.
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, die allgemeine Anwendbarkeit des FRET-Analysator unter optimalen FRET Temperaturbedingungen durch den Zuckergehalt von handelsüblichen Getränken zu quantifizieren. Dieses Protokoll stellt die Details des FRET Gerätebedienung sowie eine kurze Beschreibung der Sensor und die Probenvorbereitung. Wir gehen davon aus, dass dieser Bericht die Anwendung des tragbaren fördernAnalysator in kleinen Laborumgebungen und eine Grundlage für die weitere Entwicklung eines kostengünstigen Vor-Ort-Diagnosegerät mit FRET-basierten Biosensoren bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Quantifizierung des Zuckergehalts in Getränkeproben, eine maßgeschneiderte FRET – Analysator 7 bei einer optimalen Temperatur für FRET – Sensoren. Der Analysator wurde entwickelt mit einem kürzlich entwickelten, kostengünstigen 405-nm-Band Ultraviolett-LED als die Lichtquelle und zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. Diese Vorrichtung ist kostengünstiger als andere vergleichbare Fluorometer. Die Vorrichtung zeigte eine hohe Nachweis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier-Projekt (2011-0031944) und der KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
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