Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET
Summary
Этот протокол описывает быструю и высокочувствительную квантификацию Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) данных датчиков с использованием заказных портативного анализатора ладу. Устройство было использовано для обнаружения мальтозу в пределах диапазона критических температур, что обеспечивает максимальную чувствительность обнаружения, что позволяет практическую и эффективную оценку содержания сахара.
Abstract
Последние достижения в области Форстера резонансного переноса энергии (FRET) датчики позволили использовать их для обнаружения различных малых молекул, в том числе ионов и аминокислот. Однако врожденная слабая интенсивность сигнала датчиков FRET является серьезной проблемой, которая препятствует их применению в различных областях и делает использование дорогих, высокого класса флуорометры необходимо. Ранее мы создали экономически эффективное, высокопроизводительное FRET анализатор, который может конкретно измерить отношение двух эмиссионных диапазонах длин волн (530 и 480 нм) для достижения высокой чувствительности обнаружения. Совсем недавно было обнаружено, что FRET датчики с бактериальным периплазматических белков, связывающих обнаружить лиганды с максимальной чувствительностью в критическом интервале температур от 50 – 55 ° C. Этот отчет описывает протокол для оценки содержания сахара в коммерчески доступных образцов напитков с использованием нашего портативного анализатора FRET с датчиком температуры FRET конкретного. Наши результаты показали, что дополнительный предварительный нагревПроцесс датчика FRET значительно увеличивает отношение сигнал FRET, чтобы обеспечить более точное измерение содержания сахара. На заказ FRET анализатор и датчик были успешно применены для количественного определения содержания сахара в трех типах коммерческих напитков. Мы ожидаем, что дальнейшее уменьшение размера и производительности улучшение оборудования будет способствовать использованию ручных анализаторов в средах, где высококачественное оборудование не доступно.
Introduction
Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) широко используется в качестве биометрический датчик для обнаружения малых молекул , таких как сахара, ионов кальция и аминокислот 1-4. FRET биосенсоры содержат флуоресцентные белки, голубому флуоресцентные белки (СЛТ) и желтый флуоресцентные белки (YFPs), которые сливают с обоих концов периплазматических-связывающего протеина (ПСП). Сугарс связываются с ПСБ, расположенных в середине датчика FRET, вызывая структурные изменения в датчике, который впоследствии варьировал расстояние и дипольным ориентация двух флуоресцирующих белков в любом конце РВР. Это изменение позволяет количественного анализа содержания сахара путем измерения отношения длин волн излучения EYFP (530 нм) и ECFP (480 нм). Благодаря высокой чувствительности, специфичности, возможности мониторинга в режиме реального времени, а также быстрое время отклика FRET биосенсоров, эти датчики широко используются в экологических, промышленных и медицинских применений 5. Кроме того, ratiomИзмерение etric с использованием FRET биосенсоров имеет важные практические преимущества, так как он может быть использован для измерения компонентов в сложных биологических образцах, где концентрация датчик не может легко контролировать и фоновой флуоресценции всегда присутствует.
Несмотря на эти преимущества датчиков на основе FRET для количественной визуализации, небольшие структурные изменения с неполным домена движения-передачи к флуоресцентных белков производят интенсивность по своей сути слабый сигнал. Этот слабый сигнал ограничивает применение датчиков FRET основе для в пробирке или в естественных условиях анализа 6. Следовательно, большинство FRET биосенсоры требуют применения дорогостоящих и высокочувствительного оборудования. Ранее мы разработали недорогой и портативный анализатор ладу возможностями , аналогичными существующих флуоресцентных анализаторов 7. В этом устройстве, недорогой 405-нм диапазона ультрафиолетового света на светоизлучающих диодах (СИД), был использован в качестве источника света, чтобы вызвать возбуждение госигнал флуоресценции е, заменяя дорогую лампу или лазер. Система обнаружения анализатора эффективно фокусирует сигнал флуоресценции рассеивая на двух фотоприемников с кремниевым фотодиодом. В более позднем исследовании мы показали , что оптимизация температуры обнаружения при 50 – 55 ° С может существенно увеличить радиометрический сигнал FRET 8. Это усиление сигнала температуры конкретных, наряду с заказного анализатором FRET, позволяет использовать датчики FRET в более общих диагностических применений с быстрой и высокой чувствительностью.
В этом протоколе мы продемонстрировали общую применимость анализатора FRET при оптимальных температурных условиях FRET путем количественного определения содержания сахара в коммерчески доступных напитков. Этот протокол обеспечивает детали операции FRET устройства, а также краткое описание датчика и подготовки проб. Мы ожидаем, что этот доклад будет способствовать потенциальное применение портативногоАнализатор в небольших лабораторных условиях и обеспечивают основу для дальнейшего развития недорогого на месте диагностического устройства с биосенсоров FRET основе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет быстро и эффективно количественно оценить содержание сахара в образцах напитков, с использованием заказных FRET анализатор 7 при оптимальной температуре для датчиков ладу. Анализатор был разработан с недавно развитой, недорогой 405-нм полоса ультрафиолетов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами от Intelligent синтетической биологии Центра глобального проекта Frontier (2011-0031944) и Программы KRIBB исследовательской инициативы.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
