Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Summary

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Abstract

Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine führende Ursache für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität in den entwickelten Ländern und Tiermodellen, die zuverlässig die menschliche Krankheit zu reproduzieren sind notwendig, um neue Therapien für diese Krankheit zu entwickeln. Die Maus hindlimb Ischämie-Modell wurde für diesen Zweck, aber die gängige Praxis zu induzieren akute Ischämie der Extremitäten durch Ligatur der Arteria femoralis kann führen zu erheblichen Gewebsnekrosen, gefährden Ermittler die Fähigkeit zur Untersuchung der Gefäß und Skelettmuskelgewebe Reaktionen auf Ischämie weit verbreitet . Ein alternativer Ansatz zur Femoralarterie Ligierung ist die Induktion der graduellen Femoralarterie Okklusion durch die Verwendung von Ameroid constrictors. Wenn sie um die Oberschenkelarterie in der gleichen oder verschiedenen Stellen wie die Stellen der Femoralarterie Ligatur gelegt, okkludieren diese Vorrichtungen die Arterie über 1 – 3 Tage, was zu allmählicher, subakute Ischämie. Dies führt zu weniger beträchtliche Nekrose Skelettmuskelgewebe, which mehr nachahmen kann genau die Reaktionen im menschlichen PAD gesehen. Da der genetische Hintergrund Einflüsse Ergebnisse in den beiden akuten und subakuten Ischämie-Modellen Berücksichtigung der Mausstamm beobachtet, die bei der Auswahl der besten Modell wichtig ist. Dieses Papier beschreibt die richtige Verfahren und anatomische Platzierung der Ligatur oder Ameroid constrictor auf der Maus Femoralarterie subakuten oder akuten hinteren Gliedmaßen Ischämie in der Maus zu induzieren.

Introduction

Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine führende Ursache für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität in den entwickelten Ländern ^1. PAD Ergebnisse von atherosklerotischen Obstruktion der peripheren Arterien, die mit den daraus resultierenden Belastungs oder Ruheschmerzen zu Extremitäten-Ischämie führt und gelegentlich nicht heilende Geschwüre und Gangrän, die Amputation von Gliedmaßen erforderlich machen. Therapien PAD Targeting sind darauf gerichtet , in erster Linie in Richtung endovaskuläre ² oder chirurgische Revaskularisation ^3, wie im wesentlichen keine wirksame medizinische Therapien ⁴ existieren.

Leider ist Revaskularisierung oft von begrenztem Nutzen, da Bypässen hohen Ausfallraten (bis zu 50% innerhalb von 5 Jahren) ⁵ , die in einigen Populationen schlimmer sind (zB Raucher, Frauen, nicht Vena saphena – Transplantate) ^6,7. Endovaskuläre Ansätze, wie Angioplastie und Stent-Implantation, werden auch durch hohe Restenoseraten beeinträchtigt (mehr als 50% innerhalb von 1 Jahr), particulary in ⁸ femoropoplitealen Krankheit, obwohl die Verwendung von Medikamenten-freisetz Ballons und Stents Ergebnisse etwas ^9-11 verbessert hat. Um neue Therapien für PAD zu entwickeln, ist es wichtig, Tiermodelle zu entwickeln, die zuverlässig die menschliche Krankheit zu reproduzieren.

Bis heute ist das häufigste Modell der PAD ist die hinteren Gliedmaßen Ischämie – Modell (HLI), die am häufigsten in Mäusen durchgeführt ^12,13. In ihrer häufigsten Manifestation bringt das Modell chirurgische Ligation des proximalen und distalen Oberschenkelarterie und die dazwischenliegenden Seitenäste durch Exzision des Schiffes gefolgt, in Okklusion des Blutflusses und die Induktion von akuter Ischämie der Gliedmaßen zur Folge hat. HLI wurde in erster Linie zur Untersuchung der Angiogenese und Arteriogenese Reaktionen in peripheren Gliedmaßen Muskelgewebe und die Wirkungen von verschiedenen Therapien (zB Medikamente, Genabgabe, Stammzellen) auf diesen Reaktionen verwendet. In jüngerer Zeit hat sich unsere Gruppe dieses Modell die Rolle von Skelettmuskelzellen zu untersuchen, verwendeten in die Antwort ¹⁴ Ischämie und die Auswirkungen der genetischen Unterschiede auf die Ergebnisse zu Gliedmaßen.

Das HLI – Modell hat sich unser gegenwärtiges Verständnis erleichtert , dass die Gefäß- und Muskelreaktionen auf Ischämie auf Genetik abhängig sind (dh Inzuchtstamm) ^{15, 16} Jahre alt, und das Vorhandensein oder Fehlen von anderen Krankheiten oder Bedingungen , die für Atherosklerose, einschließlich Diabetes mellitus ¹⁷ und Hypercholesterinämie ^18. Allerdings ist eine wichtige Schwäche des traditionellen HLI – Modell , dass es sich um ein Modell der akuten Extremitäten – Ischämie ist ^12,13, während menschliche PAD chronische Ischämie als Folge der allmählichen Entwicklung der okklusiven atherosklerotischen Läsionen in den peripheren Arterien verursacht.

In einem Versuch , diese Schwäche zu umgehen, Tang und Kollegen zunächst ein Rattenmodell der allmählichen Oberschenkelarterienverschluss entwickelt mit Ameroid constrictors ¹⁹ und die gleiche Gruppe , die später developed ein ähnliches Mausmodell ^20. Ameroid constrictors wurden in einem Hunde – Modell der chronischen Myokardischämie ^21,22 ursprünglich in den 1950er Jahren beschrieben. Diese Vorrichtungen haben eine äußere Metallhülse umschließt eine innere Schicht aus einem hygroskopischen Material, üblicherweise Casein und wenn sie um eine Arterie platziert sie induzieren graduelle Gefäßverschluss, da sie Feuchtigkeit aus den umgebenden Geweben zu absorbieren. In ihrer Modifikation des Modells, Yang et al. Platziert constrictors sowohl auf der proximalen und distalen Oberschenkelarterie an Stellen analog zu den chirurgischen Ligationsstellen, und sie ligiert , die Seitenzweige der Femoralarterie, wie in dem herkömmlichen Modell. Im Vergleich zu akuten HLI führte Ameroid constrictor-induzierte Ischämie bei niedriger Expression von inflammatorischen und schubspannungsabhängigen Gene, senkt den Blutfluss Recovery 4 – 5 Wochen nach der Operation, und weniger Muskelnekrose ^20. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde es, dass die schrittweise Arterienverschluss fühlte ein Modell P liefern könnteAD mehr relevant für die menschliche Krankheit.

Bemerkenswert ist , in dem ursprünglichen Bericht, Auswirkungen von Ameroid Konstriktor induzierte Ischämie wurden nur in C57BL / 6 – Mäusen ^19, untersucht , die auf ¹⁵ – Nekrose ischämisch induzierter Muskel relativ resistent sind. Wir modifizierte kürzlich die allmähliche Ischämie – Modell weiter und erforscht ihre Auswirkungen in der mehr Ischämie-anfälligen BALB / c – Maus – Stamm ^23. In der ersten Manifestation des Modells, legten wir constrictors sowohl auf der proximalen und distalen Oberschenkelarterie ließ aber alle Seitenzweige intakt. In einer zweiten, milder Modifikation, legten wir einen einzigen constrictor nur auf der proximalen Arteria femoralis und wieder links alle Seitenzweige der Arterie intakt. In beiden Modifikationen dieses Modells haben wir festgestellt, dass BALB / c-Mäusen, aber nicht C57BL / 6-Mäuse, zeigten eine signifikante Muskelnekrose trotz ähnlicher Blutfluss und Gefäßdichte. Ähnlich wie unsere früheren Studie ¹⁴ zeigten diese Ergebnisse , dass Gliedmaßen MuskelVerletzungen nicht allein durch den Blutfluss beeinflusst, sondern ist teilweise abhängig von genetischen Hintergrund. Darüber hinaus fanden wir, dass Gliedmaßen Blutfluss zu seinem Nadir innerhalb von 3 Tagen fiel, so dass das Modell scheint mehr ein von 'subakute' zu sein, anstatt schrittweise Extremitäten-Ischämie.

Auf der Grundlage dieser früheren Studien scheint es klar, dass ein einheitliches Verfahren zur hinteren Gliedmaßen Ischämie induziert nicht in allen Fällen geeignet sein können. Da eine Vielzahl von Bedingungen (zB genetische Unterschiede und das Vorhandensein oder Fehlen von Komorbiditäten) beeinflussen sowohl die vaskuläre und Skelettmuskel-spezifischen Antworten, Ermittler finden es notwendig , die Chronifizierung und / oder die Schwere der hinteren Gliedmaßen Ischämie am besten zu ändern passen ihre Zwecke. Des Weiteren vor Beschreibungen des Modells typischerweise geeignete anatomische Orientierungspunkte fehlten zuverlässige inter Ermittler Reproduzierbarkeit der Technik zu erleichtern. In diesem Dokument werden Verfahren zur entweder akute oder subakute hindlimb Ischämie in der Maus zu induzierenwerden beschrieben und präzise sind anatomische Orientierungspunkte zur Verfügung gestellt.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß dem Protokoll vom Herzog Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. Männliche Mäuse wurden in dieser Studie verwendet, obwohl beiderlei Geschlechts verwendet werden, wie für den wissenschaftlichen Zweck der Studie angegeben. 1. Haarentfernung Vor der Einleitung der Narkose, eine präoperative Vorbereitungsbereich, bestehend aus einem abgedeckten Heizkissen gesetzt bei 37 ° C und einer nosecone Port angeschlossen kontin…

Representative Results

Richtige Identifizierung der Maus hindlimb Vaskulatur ist kritisch Reproduzierbarkeit der Techniken zur Gewährleistung sowohl subakute und akute Ischämie der hinteren Gliedmaßen Induzieren wie hier beschrieben. Zusätzlich zu der inhärenten Variation in Tierstudien können andere Faktoren Variabilität in Laser Doppler Perfusion Imaging (LDPI) einzuführen, einschließlich der Art der Anästhesie, die Position des Tieres (supine vs. anfällig) und Körpertemperatur (siehe <s…

Discussion

Vielleicht ist der schwierigste Schritt bei diesem Verfahren ist die Trennung von der Femoralarterie von der Femoralvene. Der größere Durchmesser und dünnere Wände der Femoralvene, die denen der Arterie im Vergleich zu erhöhen seine Anfälligkeit während der chirurgischen Manipulation zu durchstechen und zu zerreißen. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Vene stören können, indem sie die Wunde feucht mit einem sterilen Tupfer angefeuchtet mit PBS reduziert werden. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass alle …

Materials

Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps	Fine Science Tools	11200-14	Inox
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
7-0 Silk Suture	Sharpoint	DA-2527N
5-0 Coated Vicryl Suture	Ethicon	J463G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11053-10
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Artifical Tears Ointment	Rugby Laboratories	0536-6550-91
Surgical Tape	3M	1530-0
Fine Cotton Swabs	Contec	SC-4
Temperature Controller	Physitemp	TCAT-2DF
Ameroid Constrictors	Research Instruments SW	MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific	39DP
Needle Driver	Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline	Gibco	10010-023
Moor LDPI	Moor Instruments	moorLDI2
moorLDI Measurement software	Moor Instruments	v. 6.0
Hair Removal Cream	Nair