Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia
Summary
Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.
Abstract
malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati, e modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana sono necessarie per lo sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Il modello di topo hindlimb ischemia è stato ampiamente utilizzato per questo scopo, ma la pratica standard di indurre ischemia dell'arto acuta mediante legatura dell'arteria femorale può provocare la necrosi tissutale sostanziale, compromettere la capacità degli investigatori di studiare le risposte vascolari e tessuto muscolare scheletrico all'ischemia . Un approccio alternativo alla legatura dell'arteria femorale è l'induzione di progressiva occlusione dell'arteria femorale attraverso l'uso di costrittori AMEROID. Quando posizionato intorno femorale uguali o differenti posizioni come i siti di legatura dell'arteria femorale, questi dispositivi occludono l'arteria più di 1 – 3 giorni con conseguente più graduale, subacuta ischemia. Ciò si traduce in meno consistente necrosi dei tessuti muscolo scheletrico, which può imitare più da vicino le risposte visto in PAD umana. Perché background genetico influenze esiti in entrambi i modelli di ischemia acuta e subacuta, considerazione del ceppo di topi in fase di studio è importante nella scelta del modello migliore. Questo documento descrive la procedura corretto posizionamento anatomico di legature o costrittori AMEROID sul mouse arteria femorale per indurre subacuta o ischemia degli arti posteriori acuta nel topo.
Introduction
Malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati 1. risultati PAD da ostruzione aterosclerotica delle arterie periferiche che porta a ischemia con conseguente dolore da sforzo o di riposo e, occasionalmente, ulcere e cancrena che necessitano di amputazione degli arti non-guarigione. Terapie mirate PAD sono dirette principalmente verso endovascolare 2 o rivascolarizzazione chirurgica 3, come essenzialmente terapie mediche efficaci esistono 4.
Purtroppo, la rivascolarizzazione è spesso di beneficio limitato, come bypass hanno alti tassi di fallimento (fino al 50% entro 5 anni) 5 che sono peggio in alcune popolazioni (ad esempio, per fumatori, le donne, non vena safena innesti) 6,7. approcci endovascolari, come angioplastica e stenting, sono anche compromesse da elevati tassi di restenosi (superiore al 50% in 1 anno), particolarmente in femoropoplitea malattia 8, anche se l'uso di palloncini e stent medicati ha migliorato i risultati un po '9-11. Al fine di sviluppare nuovi trattamenti per la PAD è essenziale sviluppare modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana.
Fino ad oggi, il modello più comune della PAD è il modello degli arti posteriori ischemia (HLI), che viene più frequentemente eseguita nei topi 12,13. Nella sua manifestazione più comune, il modello comporta legatura chirurgica dell'arteria femorale prossimale e distale e suoi intermedi rami laterali seguita da escissione della nave, con conseguente occlusione del flusso sanguigno e induzione di ischemia dell'arto acuta. HLI è stato utilizzato principalmente per studiare le risposte angiogeniche e arteriogenic nel tessuto muscolare degli arti periferici e gli effetti di varie terapie (ad esempio, la droga, la consegna del gene, le cellule staminali) su queste risposte. Più di recente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per esaminare il ruolo delle cellule del muscolo scheletrico in la risposta alla ischemia e gli effetti delle differenze genetiche sui risultati 14.
Il modello HLI ha facilitato la nostra comprensione corrente che le risposte vascolari e muscolari all'ischemia dipendono genetica (cioè, ceppo inbred) 15, 16 anni, e la presenza o assenza di altre malattie o condizioni pertinenti ad aterosclerosi, compreso il diabete mellito 17 e ipercolesterolemia 18. Tuttavia, un importante debolezza del modello tradizionale HLI è che è un modello di ischemia acuta 12,13, mentre PAD umana provoca ischemia cronica a seguito del progressivo sviluppo di lesioni aterosclerotiche occlusive nelle arterie periferiche.
Nel tentativo di aggirare questa debolezza, Tang e colleghi hanno inizialmente sviluppato un modello murino di graduale occlusione arteriosa femorale utilizzando constrictor AMEROID 19, e lo stesso gruppo poi developed un modello di topo simile 20. Costrittori AMEROID sono stati descritti inizialmente nel 1950 in un modello canino di ischemia miocardica cronica 21,22. Questi dispositivi hanno un manicotto metallico esterno che racchiude uno strato interno di un materiale igroscopico, di solito di caseina, e quando disposto intorno un'arteria inducono progressiva occlusione di vasi che assorbono l'umidità dai tessuti circostanti. Nella modifica del modello, Yang et al. Costrittori posizionato su entrambi prossimale e distale femorale in siti analoghi ai siti legatura chirurgica, e ligato i rami laterali dell'arteria femorale, come nel modello tradizionale. Rispetto al HLI acuta, ischemia AMEROID constrictor indotta portato a bassa espressione di geni infiammatori e di taglio di stress-dipendente, più bassa di recupero il flusso di sangue 4 – 5 settimane dopo l'intervento, e meno necrosi muscolare 20. Sulla base di queste osservazioni, si è ritenuto che progressiva occlusione arteriosa potrebbe fornire un modello di PAD più rilevante per la malattia umana.
In particolare, nel rapporto originale, effetti di AMEROID ischemia indotta constrictor sono stati esaminati solo in topi C57BL / 6 19, che sono relativamente resistenti alla ischemia indotta necrosi muscolare 15. Recentemente abbiamo modificato il modello di ischemia graduale ulteriormente e esplorato i suoi effetti nel più ischemia-sensibili BALB / c del mouse ceppo 23. Nella prima manifestazione del modello, abbiamo messo constrictor sia prossimale e distale femorale ma lasciato intatti tutti rami laterali. In un secondo, modifica mite, abbiamo posizionato un singolo costrittore solo sulla arteria femorale prossimale e ancora lasciato tutti collaterali rami dell'arteria intatta. In entrambe le modifiche di questo modello, abbiamo scoperto che i topi BALB / c, ma non C57BL / 6 topi, visualizzata significativa necrosi muscolare pur avendo simile flusso di sangue e la densità vascolare. Simile al nostro precedente studio 14, questi risultati hanno dimostrato che il muscolo degli artipregiudizio non è solo influenzata dal flusso di sangue, ma è in parte dipendente background genetico. Inoltre, abbiamo scoperto che il flusso di sangue arto è sceso al suo nadir entro 3 giorni, così il modello sembra essere più uno dei 'subacuta' piuttosto che graduale ischemia degli arti.
Sulla base di questi studi precedenti, appare chiaro che un singolo metodo per indurre hindlimb ischemia può non essere adatto in tutti i casi. A causa di una varietà di condizioni (ad esempio, le differenze genetiche e la presenza o assenza di condizioni di co-morbidità) influenza sia il vascolare e le risposte specifiche del muscolo scheletrico, gli investigatori potrebbe essere necessario modificare la cronicità e / o la gravità delle arti posteriori ischemia al meglio soddisfare i loro scopi. Inoltre, precedenti descrizioni del modello tipicamente mancavano punti di riferimento anatomici idonee ad agevolare affidabile inter-investigatore riproducibilità della tecnica. In questo lavoro, i metodi per indurre ischemia degli arti posteriori acuta o subacuta nel toposono descritti, e punti di riferimento anatomici precisi sono forniti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forse il passo più difficile in questa procedura è la separazione dell'arteria femorale dalla vena femorale. Il diametro maggiore e pareti più sottili della vena femorale rispetto a quelli dell'arteria aumentano la suscettibilità alle perforazioni e strappi durante la manipolazione chirurgica. La probabilità di interferire vena può essere ridotto mantenendo la ferita umida utilizzando un tampone sterile inumidito con PBS. È altresì importante garantire che tutti pinze sono affilate, allineate, e priva di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grants R21HL118661, R56HL124444, and R01HL124444 to CDK, and by NIH grants R00HL103797 and R01HL125695 to JMM.
Materials
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7-0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5-0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
- Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
- Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
- Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
- Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
- Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
- Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
- Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
- Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
- Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
- Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
- Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
- Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
- Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
- Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
- Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
- Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
- Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
- McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).
