과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
대 식세포와 수지상 세포 (DC가)는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 담당 조직과 림프 기관에서 발견되는 선천성 면역 세포이다. 그러나 따라서, 시험 관내 모델이 개발되었으며, 자세하게 공부 충분한 수의 분리하기가 어렵다. 골수 유래 대 식세포 및 수상 세포의 체외 배양 면역 연구 노포 가치있는 방법이다. 여기서, 배양 및 사이토킨 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용하여 기본 마우스 골수 세포의 단일 배양액으로부터 수지상 세포 및 대식 세포를 모두 식별하기위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 제 루츠 동부 등에 의해 개발 된 기존의 방법에 기초한다. 골수 유래 수지상에 대한 1천9백99인치 문화는 이질적이며, MHCII 및 형광 표지 히알루 론산 (FL-HA)의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구분하는 데 사용됩니다. 이러한 GM-CSF는 유래 대 식세포 프로밀접하게 표현형과 기능 모두에서 폐포 대 식세포 유사 체외 파생 된 대 식세포의 편리한 소스를 제공해 줄.
서론
몇몇 시험 관내 배양 방법은 골수 유래 대 식세포 (BMDMs) 및 하나 이상의 성장 인자의 조합을 사용하여 골수 - 유래 수지상 세포 (BMDCs)를 생성하기 위해 설명되었다. BMDMs는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 또는 GM-CSF, 2를 사용하여 골수 세포를 배양하여 생성 될 수있다. BMDCs를 들어, 골수 문화 FLT3 리간드의 추가 (B220 + 각각의 CD11c 높은 / MHCII 높이의 CD11c 보라)을 문화 3,4 9 일 후 비 부착 클래식 형질 수지상을 발생시킨다. 대조적으로, 비 - 부착 세포는 GM-CSF 단독 5,6- 함께 배양 7 내지 10 일 후에 생성, GM-CSF 및 IL-4 7 또는 GM-CSF 및 FLT3 리간드 8,9 BMDCs 더 자세히 염증성 수지상 닮은 생성 (중 CD11c 높은, MHCII 높은 CD11b를 +) 10. 이러한 시험 관내 배양 물 식세포를 생성하는데 사용되는 동안 또는각각의 문화는 순수한 인구를 초래하는 경우 DC가, 그것은 명확하....
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프로토콜
마우스는 브리티시 컬럼비아 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인 절차에 의한 윤리적 인 동물 연구를위한 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 안락사시켰다.
1. 마우스 대퇴골과 경골에서 단일 세포 골수 서스펜션 취득
- 생물 안전 캐비닛 (BSC) 70 % 에탄올로, 다음 청소 / 스프레이 BSC 표면을 캐비닛 공기를 제거하고 공기 흐름의 안정화를 허용하는 과정의 시작에 앞서 15 분에 전환합니다. 프로토콜의 전체에 대한 가능한 한 무균 모든 것을 유지. 비 멸균 상태에서 뼈를 절단하지 마십시오.
- 70 % 에탄올에 몸을 담근에 의해 해부 도구를 준비, 5 % 소 태아 혈청 (HBSS-FCS), 멸균 페트리 접시 (100mm X 15mm), 1 행크의 균형 소금 솔루션 (해부 가위, 집게 2 쌍의 1 쌍) BSC에있는 ML의 주사기 26½ 게이지 바늘 원추형 수집 튜브 (15 ml를 50 ml)에 용해시키고, 종이 타월.
- 사용하여 마우스를 안락사기관의 동물 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜. 상기 BSC로 가져와 하나 또는 두 종이 수건 위에 배치하고 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.
- 뚜껑에 2 ml의 - BSC에에서 나누어지는,베이스에 HBSS-FCS 10 ml의 1을 멸균 페트리 접시에 무균를 엽니....
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결과
이 방법의 주요 단계를 요약하는 흐름도가도 1에 도시되어있다. 배양 여러 번 골수 배양의 밀도 및 형태가도 2에 도시되어있다. 제 1 일에, 세포가 작은 저밀도이지만 날 (3)이다 거기에 더 많은 세포는 몇 가지 큰하고 몇 준수하기 시작했다. 6 일 일정한 부착 성 및 비 - 부착 부분 (도 2A)가 존재한다. 배양은 7 일부터 수확 될 수있는 - 일 10도 2b에 존재하는 CD11c + 세포를 높은 비율로 10 것은 수확 전 7 일째 배양뿐만 아니라 분리 된 점착성 및 비 점착성 세포 분획을 나타낸다. 자기편 부분은 비 접착 부분을 제거 빛 세척 후 남아있는 세포로 구성되어 있습니다. 비 - 부착 성 분획을 크게 확대 디지털 메신저에보다 명확하게 알 수있는 수지상 형태로 세포 충실도 2b의 세트에서.......
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토론
이 논문에서는 루츠 외. (6)로부터 구성되는 단일 마우스 골수 배양 물에서 GM-CSF 유도 된 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 이 문화의 미성숙 수지상 세포와 대 식세포을 구별 결합 MHCII 표현과 FL-HA 이전에 곤란 하였다 (그림 3C 참조). 이것은, 함께 Helft 등. (19)에 의해 다른 보고서로, 이전에는 수지상 것으로 생각되었다 GM-CSF 유도 BMDC 문화에서 이질성을 보여줍니다. Helft 등. (19)은 아직도 상당한 대식 세포 인구를 발견 BMDCs를 생성하는 매우 다른 배양 조건을 사용했다. GM-CSF에 의한 대 식세포는 폐포 대 식세포 유사 및 FLT3 리간드 보충 BMDC 문화는 고전과 형질 DC가 3,4를 생산하는 반면, GM-CSF 유도 수지상 세포는 염증 DC가 유사. 다른 DC와 대식 세포 인구는 .......
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공개 사항
저자는 재정적 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 연구 (CIHR) (교부금 MOP-119503)과 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회 (NSERC)의 캐나다 연구소에 의해 투자되었다. NSERC도 YD하는 여름 studentships을 지원 AA YD는 4 년 교제 수상 브리티시 컬럼비아 대학 (UBC)에서 지원, AA는 대학원생의 석사 수상 (CGS-M)와 CIHR에 의해 지원됩니다. 우리는 그림 2의 이미지를 생성하는 데 사용되는 현미경으로 지원 캘빈 Roskelley 감사합니다. 우리는 또한 UBC 동물 및 유동 세포 계측법 시설의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 유세포 분석기 | BD | LSR-II | |
| 자동 도립 현미경 | 라이카 | DMI4000 B | |
| 원심분리기 | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| 주사기 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 게이지 바늘 | BD | 305111 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Corning | 357070 | *Falcon 브랜드 |
| Eppendorf 튜브 (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *다양한 | *해부 가위, dumont 집게 및 표준 집게 |
| 혈구계 | Reichert | 1490 | |
| 멸균 100mm x 15mm 페트리 접시 | Corning | 351029 | *Falcon 브랜드 |
| 2-메르캅토에탄올 | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| 염화암모늄 | BDH | BDH0208-500G | |
| 소 혈청 알부민 | Fisher 생물 시약 | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | 에틸렌디아민테트라아세트산 |
| 태아 소 혈청 | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| 인산 칼륨 단일염기성 | BDH | BDH0268-500G | |
| 염화칼륨 | BDH | BDH9258-500G | |
| 재조합 GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| 수탉 빗 히알루론산 나트륨 | Sigma | H5388-1G | *플루오레세인 히알루로난 |
| RPMI-1640을 만드는 데 사용됩니다 | Thermo Fisher | 21870-076 | 피루브산 나트륨 없음, 글루타민 없음. 37 ° C를 사용하기 전에. |
| 염화나트륨 | 피셔 | 5271-10 | |
| 인산나트륨 이염기성 | 시그마 | 50876-1Kg | |
| 피루브산나트륨 | 시그마 | P5290-100G | |
| 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 | 피셔 생물 시약 | BP152-5 | |
| 트리판 블루 | 시그마 | T8154 | |
| 안티 FC 수용체(라벨이 지정되지 않음), 조직 배양 상등액 | N/A | N/ | A 클론: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | 클론: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | 클론: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | 클론: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | 염소 폴리클론 IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| 프로피듐 요오드화물 | 시그마 | P4170-25MG | |
| DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) | 시그마 | D9542-5MG |
참고문헌
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), ....
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재인쇄 및 허가
