ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק
Summary
Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Abstract
המוח האנושי הוא איבר זוללי אנרגיה אנרגיה שמסתמכת בעיקר על גלוקוז כמקור דלק. גלוקוז catabolized ידי המיטוכונדריה במוח באמצעות הגליקוליזה, חומצה תלת-קרבוקסיליות (TCA) זירחון מחזור חמצוני (OXPHOS) מסלולים לייצר את האנרגיה בתאים בצורת אדנוזין אדנוזין (ATP). ירידת ערך של ייצור ATP במיטוכונדריה גורמת להפרעות המיטוכונדריה, המציגי קליני עם תסמינים נוירולוגיים myopathic בולטים. פגמים מיטוכונדריאלי נוכחים גם הפרעות התפתחותיות (הפרעת ספקטרום האוטיזם למשל) והפרעות ניווניות (למשל amyotrophic טרשת לרוחב, אלצהיימר ופרקינסון). לפיכך, יש התעניינות מוגברת בתחום לביצוע ניתוח 3D של מורפולוגיה המיטוכונדריה, מבנה והפצה הן לפי מדינות בריאות מחלה. מוח המורפולוגיה המיטוכונדריה היא מגוונת מאוד, עם כמה המיטוכונדריה במיוחד אלההאזור הסינפטי להיות בטווח של קוטר <200 ננומטר, שהוא מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור המסורתית. הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) במוח מגביר באופן ניכר את זיהוי organellar ידי מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, זה לא להתגבר על אילוצים על הרגישות של זיהוי של המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית ללא oversaturating התמונות של המיטוכונדריה גדול בגודל. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סדרתי שימש בהצלחה לאפיין המיטוכונדריה ב הסינפסה העצבית, טכניקה זו היא מאוד זמן רב במיוחד כאשר משווים דגימות מרובות. מיקרוסקופיה אלקטרונים סורקים סדרה לחסום פנים (SBFSEM) הטכניקה כוללת בתהליך אוטומטי של חתך, בלוקי הדמיה של רכישת רקמות ונתונים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבצע SBFSEM של אזור מוגדר מהמוח מכרסם לשחזר במהירות ולדמיין מורפולוגיה המיטוכונדריה. טק זהnique יכול לשמש גם כדי לספק מידע מדויק על מספר המיטוכונדריה, נפח, גודל והפצה באזור המוח מוגדר. מאז רזולוציית התמונה המתקבלת היא גבוהה (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) פגמים מורפולוגיים ברוטו המיטוכונדריה יכול גם להתגלות.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים דינמיים אשר משנים את צורתם ומיקומם תלוי רמזים הסלולר וצרכימים, באינטראקציה הדוקה עם שלד תא תא, ובתגובה לאירועים סלולריים כמו זרמי סידן בנוירונים 1. המיטוכונדריה גם אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים למשל reticulum endoplasmic, אשר בתורו מסדיר הדינמיקה שלהם המטבוליזם 2. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי מראה ההטרוגניות של סוגי תאים שונים כלומר. את הצורה של אברון משתנית צינורי לזה מורכב יריעות, צקי אליפסות 3. הוכח כי חלבוני מחזור היתוך וביקוע המיטוכונדרי יכולים לווסת את המיקום, גודל, צורה והפצה של המיטוכונדריה 4. יתר על כן, שינויים בצורת המיטוכונדריה המשויכים ניווניות של מערכת עצבים, פלסטיות עצבית, ניוון שרירים, איתות סידן, דור מיני חמצן תגובתי כמו גם תוחלת חיים ומות תא להפליל that תא ספציפי מורפולוגיה המיטוכונדריה היא קריטית לשמירה על תפקוד סלולארי רגיל 5-11.
פונקצית bioenergetic גדולה של המיטוכונדריה היא ליצור אדנוזין אדנוזין (ATP) על ידי ביצוע סדרה של תגובות מטבוליות שכוללות פירוט מלא של חומרי הזנה (גלוקוז כלומר, חומצות-שומן או אמינו חומצות) דרך מחזור TCA ו OXPHOS מסלולי 12. המוח האנושי מהווה רק 2% ממשקל הגוף אולם היא צורכת ~ 20% מהאנרגיה הכוללת המיוצר מה שהופך אותו באנרגיה מאוד תובעני איבר 13. לכן זה לא מפתיע כי תפקוד המיטוכונדריה בבני האדם מוביל למספר רב של ביטויי נוירולוגיות 14-17. מוטציות גנטיות רכיבי OXPHOS הפוגעות מובילים דור ATP להפרעות המיטוכונדריה 17,18, אשר הן קבוצה הטרוגנית קליני של הפרעות עם שכיחות של ~ 1: 5,000 אנשים, ואחד הגורם השכיח ביותר של מ 'פרעות etabolic אצל ילדים ומבוגרים. גירעון של ATP נגזרות המיטוכונדריה משפיע על מערכות איברים מרובות עם איברים בדרישת אנרגיה גבוהה כגון מוח, לב ושרירי שלד להיות מושפעים בעיקר בחולים אלו 14,17,18. בשנים האחרונות, מחקרים רבים סיפקו ראיות תפקוד המיטוכונדריה הן הפרעות התפתחותיות ו ניווניות 15-17,19,20. מאז המיטוכונדריה חיוני קריטיים להתפתחות המוח ותפקודו, קיים הכרח לפתח פרוטוקולים שיכולים לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה מוח, מבנה, גודל, מספר והפצה תחת שני המדינות בריאות וחולות. מודלים עכבר עם חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) הופקו לדמיין תנועות המיטוכונדריה ולוקליזציה במוח 21,22. אמנם זה הוא כלי שימושי מאוד לבחון תנועתיות המיטוכונדריה והפצה כללית, ישנם כמה חסרונות אשר includדואר רזולוציה מוגבלת ורגישות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תכונות אלה מקשות לעקוב אחר המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית. באופן דומה, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סדר נוצל בהצלחה כדי להציג המיטוכונדריה הסינפטי 23, אך שיטה זו היא זמן רב מאוד. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ידועה להיות מאוד דינמי כפי שהם עוברים מחזורי ביקוע ואיחוי רציפים, וברוב התאים המיטוכונדריה לשמור על רשת מחוברת ביותר 24-26. נוירונים ביותר מקוטבים תאים דנדריטים עם מרובי אקסונים מורחבים, ואת המיטוכונדריה יוצר רשת רשתי המחובר בגוף התא ייתכן שיהיה צורך להפריד כפי שהם עושים את דרכם דרך neurites אלה (איור 1). זה עושה המיטוכונדריה המוח מאוד מגוונת בגודל ובצורה. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחסום פנים סדרתי (SBFSEM) טכניקה, צפינו בעבר כי ההבדל בהיקף או גודל mitochondr extrasynapticIA למיטוכונדריה נוכחים במסופים העצבים יכול להיות הרבה כמו שש עשר לקפל 27.
קיימות מספר גישות לביצוע נפח מנתח 28, הכולל TEM סעיף סדר 29, קלטת אוטומטית איסוף ultramicrotome 30 SEM, ממוקד אלומת יוני SEM 31, ו SBFSEM 32. ניתוח SBFSEM יש יתרונות בכך שהיא כוללת את הרזולוציה כדי לספק נתונים כמותיים על הצורה, גודל מורפולוגיים, הפצת מספר אברונים כגון המיטוכונדריה באזורים עד 1 מ"מ של המוח. המבצע הטכני הוא גם הכי פחות תובעני, עם רכישת נתונים וניתוח במסגרת היכולות של מעבדות ביולוגיות רבות שאין להן ניסיון EM קודם. הופעתו של מכשירים מסחריים להפקת תמונות בסעיף דמוי סדרתי עשתה ניתוח ultrastructural 3D של רקמות טכניקה שיגרתית, אשר נוסף מאפשרת ניתוח volumetric משוחד בצורה מהירה דיר 28 </sup>. SBFSEM תואר לראשונה והשתמש בתחום הנוירוביולוגיה בשנת 2004 32, על בסיס רעיון הוצג על ידי לייטון בשנת 1981 33. מחקרים רבים מאז הקים טכניקה זו ככלי מרכזי בניתוח שחזור של מעגלים עצביים 34. יתר על כן, עבור פרויקטים בקנה מידה הרבה יותר קטן, הוא מספק ניתוח שחזור לזהות אברונים הסלולר 27,35-39. מאז, התמונות רכשו נגזרות אלקטרוני פיזור בחזרה מתח נמוך, פרוטוקולים מכתימים חדשים המשלבים טכניקות מכתימות מתכות כבדות ידועות שונות פותחו כדי להגדיל את הרזולוציה 40.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור ניצול הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים 3D וניתוח נפח של המיטוכונדריה במוח מבוסס על שיטות שבעבר שימשו על ידינו ואחרים 38,39,41. השיטות שלאחר עיבוד רקמות משמש תוארו בעבר על ידי Deerinck ואח40.
Protocol
Representative Results
Discussion
המורכבות של מערכת העצבים מהוות אתגר משמעותי בשחזור כרך גדולה של רקמה וניתוח המורפולוגיה וההפצה של אברונים כגון המיטוכונדריה עם רזולוציה נאותה. מספר תאים כולל נוירונים, oligodendrocytes ו האסטרוציטים עם תהליכים רבים המורחבת בשלושה ממדים אינטראקציה בתוך רקמת המוח 43. מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
References
- Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
- Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
- Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
- Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
- Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
- Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
- Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
- Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
- Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
- Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
- Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
- Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
- Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
- Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
- Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
- Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
- Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
- Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
- Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
- Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
- Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
- Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
- Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
- Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
- Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
