유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 hi1045 및 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
서론
유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 (1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 말기), 3 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집....
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프로토콜
1. 시험 관내 전사
- 효소 (31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 'mRNA의 캡 제품을 생성한다.
- 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H 2 O로 용출
- 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD 260 X 희석 × 40 μg의 / ㎖).
- 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H 2 O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다.
참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA.
2.....
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결과
그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B) 30 분열하는 세포. 묘화 셀의 수 (도 2C)을 산출 하였다 묘화 세포 유사 분열 세포 수의 비율을 차지한다. 이 데이터는 이미지화되는 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B)하지만 세포의 적은 숫자 유사 분열을 겪고 세포의 낮은 숫자가없는 .......
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토론
이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세포 배양 시스템에 비해 이점이있다 취득 할 수있다. 이 프로토콜에 대한 성인 제브라 피쉬의 사용으로 인해 피부 나 눈없는 두꺼운 조직으로 인해 취득 할 수 제한된 Z-깊이로 제한됩니다. H2A.F / Z-EGFP와 mCherry-CAAX 발현 트랜스 제닉 동물이 다른 돌연변이 제브라으로 mRNA의 주사 동일한 목적은 범용성 및 편리를 위해 사용될 수 있지만 유전 교배보다 유리하다. 상황에서 유사 분열 분석이고삼일 게시물 수정 (DPF) 이상 배아 필요, 형질 전환 동물로 인해이 급속하게 발전 유기체에서 RNA의 반감기에 필요하다. .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
pCS2-H2A.F/Z-EGFP 및 pCS2-mCherry-CAAX 벡터에 대해 Kristen Kwan에게 감사드립니다. 제브라피쉬의 라이브 이미징을 가르쳐 준 Chris Rodesch에게 감사드립니다. UAB의 컨포칼 이미징과 UAB의 고해상도 이미징 시설에 도움을 준 Shawn Williams, Erik Malarkey 및 Brad Yoder에게 감사드립니다. 고해상도 이미징 시설은 UAB 종합 암 센터 지원 보조금(P30CA013148) 및 류마티스 질환 핵심 센터(P30 AR048311)의 지원을 받습니다. J.M.P.는 NIH R21 NS092105(National Institute of Neurological Disease and Stroke)의 지원을 받고 있으며, 미국 암학회(ACS IRG-60-001-53-IRG) 및 UAB 종합 암 센터(P30CA013148)의 파일럿 보조금을 받고 있습니다. S.M.P.는 Cell and Molecular Biology T32 Training Grant(5T32GM008111-28)의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pCS2 벡터 | K. Kwan | 관심 플라스미드 | |
| NotI-HF 제한 효소 | New England BioLabs | R3189S | 플라스미드 제한 분해용 |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | in vitro 전사용 |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | mRNA 정제용 |
| 100 x 15 mm 페트리 접시 | 피셔 사이언티픽 | FB0875712 | 배아 수용용 |
| 미세사출 금형 | 홈메이드 | 미세주입 중 배아 보관용 | |
| 아가로스 II | Amresco | 0815-25G | 배아 삽입용 |
| 트리카인 | 시그마-알드리치 | E10521-10G | 배아 마취용 |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S9888 | UltraPure H2O |
| 물(E3 Blue)의 경우 Sigma-Aldrich P3911 UltraPure H2O | |||
| 염화칼슘 이수화물 | Sigma-Aldrich | C8106 | 배아 수2O |
| 황산 마그네슘 | Fisher Scientific | M7506 | UltraPure H2O |
| 메틸렌 블루 하이드레이트 | 물 (E3 Blue><><) | Fisher | |
| Fisher Scientific | 50-819-812 | 녹은 아가르 | |
| 35mm 유리 커버슬립 바닥 배양 접시용 | MatTek Corp | P35G-0-20-C | 0번, 20 mm 유리, 배아 매립용 |
| #5 핀셋 | Dumont | 72701-D | 배아 제거용 |
| 21 G 1 1/2 게이지 바늘 | Becton Dickinson | 305167 | 한천에 배아 배치용 |
| 해부 현미경 | Nikon AZ100 | 배아 스크리닝 및 임베딩을 위해 모든 해부 스코프가 수행됨 | |
| 컨포칼 현미경 | Nikon A1+ | 타임 랩스 이미징 | |
| 컨포칼 소프트웨어용 | NIS Elements AR 4.13.00 | 이미지 획득 및 처리용 |
참고문헌
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder....
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재인쇄 및 허가
