Summary

تربية ذبابة الفاكهة<em> ذبابة الفاكهة</em> تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

تم توضيح طريقة لتربية ذبابة الفاكهة في ظل ظروف ممحوضة ومعروف المعايشات. وdechorionated يطير الأجنة في هيبوكلوريت الصوديوم، نقل جو معقم و مطهر لنظام غذائي العقيمة، وتربى في حاويات مغلقة. بتلقيح النظام الغذائي والأجنة مع البكتيريا يؤدي إلى الجمعيات معروف المعايشات، ويتم التأكد من وجود البكتيريا عن طريق طلاء كامل الجسم الخليط ذبابة الفاكهة.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

وترتبط معظم الحيوانات بشكل وثيق مع البكتيريا ( 'الجراثيم') من المهد إلى اللحد 1. وقد أظهرت المقارنات بين ( 'التقليدية') الحيوانات خالية من الكائنات الحية الدقيقة ( 'ممحوضة') والمرتبط الكائنات الحية الدقيقة الميكروبات تؤثر الجوانب المتنوعة لصحة الحيوان، بما في ذلك التمثيل الغذائي، التغذية، الأوعية الدموية، والكبد والجهاز التنفسي والمناعية، والغدد الصماء، وظيفة الجهاز العصبي 2. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو نموذج أساسي لفهم العديد من هذه العمليات في وجود الميكروبات 3،4 و لدراسة تأثير الجراثيم على 5،6 صحة الحيوان. لا الأنواع البكتيرية هي موجودة في كل فرد (الأساسية)، ولكن الخلالة والملبنة الأنواع تهيمن عدديا الجراثيم من كل من د اشتعلت البرية والمرباة في المختبرات و البطن. البعض Acetobacteraceae (بما في ذلك Komagataeibacter وGluconobacter)، Firmiكتيس (مثل المكورات المعوية والنستقة)، والمعوية هي إما موجودة في كثير من الأحيان في الأفراد ذبابة الفاكهة في وفرة منخفضة، أو الحالية غير منتظم في وفرة عالية 7-12.

ومتقلب والجراثيم من ذبابة الفاكهة والثدييات داخل وعبر الأجيال 14،19. الجراثيم تقلب يمكن أن يؤدي إلى الضوضاء المظهري عند قياس الصفات التي تعتمد على الجراثيم. على سبيل المثال، وتخزين Acetobacteraceae تأثير الدهون (الدهون الثلاثية) في ذبابة الفاكهة 15-18. إذا Acetobacteraceae هي أكثر وفرة في الذباب من قنينة واحدة من في 19 أخرى، يمكن أن الذباب إسوي يكون الظواهر المختلفة (20). وثمة حل لمشكلة تقلب الجراثيم في الفئران 14 من الناحية العملية منذ عام 1960، عن طريق إدخال مجتمع محدد من 8 أنواع الجراثيم المهيمنة على الجراء الماوس كل جيل جديد (تغيير النباتات Schaedler)،ضمان أن كل الجرو يتعرض لنفس الأعضاء الرئيسيين في الجراثيم الماوس. تتحكم هذه الممارسة لتكوين الجراثيم حتى عندما تكون الجراثيم ليست هي الهدف الأساسي من الدراسة 32، وتضع سابقة لضمان وجود الميكروبات الرئيسية في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية.

لتحديد تأثير الميكروبات على ذبابة الفاكهة التغذية، وقد وضعت عدة بروتوكولات لاشتقاق خطوط الطيران ممحوضة، بما في ذلك dechorionation هيبوكلوريت من الأجنة (إما مستمدة من جديد كل جيل أو حافظت الأجيال عن طريق التحويل إلى النظام الغذائي العقيمة) والعلاج بالمضادات الحيوية 13. هناك فوائد لمناهج مختلفة، مثل سهولة وسرعة لكلا العلاج المضادات الحيوية ونقل المسلسل، مقابل سيطرة أكبر من المتغيرات التباس مع دي نوفو dechorionation (على سبيل المثال، كثافة البيض والجراثيم الملوثة المتبقية، بعيدا عن الهدف تأثيرات المضادات الحيوية). بغض النظر عن طريقةإعداد وإدخال الأنواع الميكروبية المحدد لممحوضة الأجنة يسمح ثقافة ذبابة الفاكهة مع المجتمعات المحلية ( 'معروف المعايشات') محددة. بدلا من ذلك، ومحاكاة استخدام النباتات Schaedler، هذا المجتمع يمكن تلقيح البيض وضعت تقليديا (اتباع الخطوات 6-7 فقط) لضمان وجود الميكروبات التي تؤثر في سمة في كل قارورة وتجنب مضاعفات تقلب الجراثيم. نحن هنا تصف البروتوكول لرفع ذبابة الفاكهة ممحوضة ومعروف المعايشات التي كتبها دي نوفو dechorionation من الأجنة، ومؤكدا وجود الأنواع الميكروبية قدم أو تلوث.

Protocol

1. البكتيريا الثقافة (البداية ~ 1 أسبوع قبل التقاط البيض) إعداد MRS تعديل 20 (معدل وفيات الأمهات) لوحات وأنابيب مرق (الجدول 1). صب 20 مل معدلات وفيات الأمهات أجار في كل لوحة بيتري 100 ملم والسماح لتبرد / بين عشية و?…

Representative Results

وأكد تربية ناجحة من الذباب ممحوضة من العزلة لا CFUs من التجانسات في الجسم بأكمله د. الكبار البطن (الشكل 1). بدلا من ذلك، إذا جناسة مطلي غلة المستعمرات، ملوثة قارورة ويجب التخلص منها. لالذباب معروف المعايشات، تم عزل كل من العزلات البكت…

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا هو واحد من عدة طرق للجنين dechorionation 8،11،18،25،26،27، جنبا إلى جنب مع وسائل بديلة للتربية الذباب ممحوضة، بما في ذلك نقل المسلسل من البالغين ممحوضة 18،27 أو العلاج بالمضادات الحيوية 13،18. وتشمل وسائل dechorionation أخرى يغسل الايثانول وتقلل <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد الأمثل بعض تفاصيل هذا البروتوكول بمساعدة الدكتور آدم دوبسون، الذين قدموا أيضا تعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة المعاهد الوطنية للصحة (FNIH) عدد المنح R01GM095372 (JMC، A (CN) W، AJD، ودرهم). FNIH منح عدد 1F32GM099374-01 (PDN)، وجامعة بريغهام يونغ أموال بدء التشغيل (JMC، MLK، MV). تم دعم تكاليف النشر من كلية جامعة بريغهام يونغ لعلوم الحياة وقسم علوم النبات والحياة البرية.

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Play Video

Cite This Article
Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

View Video