Summary

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

Published: July 15, 2016
doi:

Summary

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Abstract

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as “Mesangiogenic Progenitor Cells”.

Introduction

Mezenşimal stromal hücreler (MSC'ler) bunların çok soyundan farklılaşma kapasitesi ve büyüme faktörleri / sitokinler salgılama hem de bağışıklık sistemi 1 bir rol hemopoiesis destekleme kapasiteleri için ilgili klinik değeri vardır. MSC-temelli tedaviler, hücre üretimi ve uygulaması tanımı tıbbi ürün (CBMP) tedavileri 3 tabanlı hücrenin güvenlik ve etkinlik için özel uluslararası düzenlemeye özellikle dikkat, geniş klinik ve klinik öncesi araştırma 2 nesne olmuştur. İnsan MSC'ler örneğin fetal sığır serumu (FBS) ve sığır tripsin gibi ek ve hayvan kökenli, reaktifler içeren ortamda yoğun kültürlenir. Bu nedenle, hücre manipülasyonu ile ilişkili enfeksiyon riskleri, hastalar prion maruz gibi proteinler, peptidler ya da hayvan kökenli diğer biyomoleküllerin bağlantılı immünolojik riski ile karşı karşıya birlikte hücre hasat ve Transplan sonra devam olabilirtation 4.

sorunu aşmak için, havuzlanmış insan AB tipi serumu (Phab'lar) FBS yerine, insan kemik iliği (SM), hayvan içermeyen ortam içinde türevi MKH'lerin kültürlenmiştir. Bu koşullar altında büyüyen MSC ile birlikte bir yeni hücre popülasyonunu tespit edilmiştir. Bu hücreler morfolojik ve MKH gelen fenotipik farklı ve kendine özgü bir gen tanımlama profili yanı sıra karakteristik büyüyen / yapışma özellikleri göstermiştir. Bu muhafaza hem mesengenic ve potansiyel anjiyojenik ve bu nedenle adlandırılmıştır Mezodermal Ata Hücreleri (MPCs) 5. Daha sonra, biz saflık 6 yüksek sınıfta MPCs üretmek için seçici ve tekrarlanabilir kültür koşulları tanımlamak başardık.

Biz daha MPCs morfolojik ve biyolojik özellikleri incelenmiştir. PPM'ler bisiklet, olumlu-Nestin yavaş gösterdi, Ki-67-negatif ve uzun telomerlerin 5 ile karakterize kromozomlar ile. Onlar plur dileipotency ilişkili transkripsiyon faktörleri Ekim-4 ve Nanog ziyade MSC ana düzenleyicileri Runx2 ve SOX9 7. mezenkimal belirteçler CD73, CD90, CD166 eksik ise fenotipik, PPM'ler MSC daha düşük seviyede endoglin (CD105) olarak ifade edilmiştir. PPM'lerin de özellikle podosome benzeri yapılar 8 ayakta yapışma PECAM (CD31) tutarlı ekspresyonu ile karakterize edilen molekül, integrinler αL (CD11a) Branşman (CD11b) αX (CD11c) ve integrin β2 (CD18) farklı bir modelini göstermektedir . Standart MSC genişleme medyada, PPM'ler derhal 9 sinyalizasyon Wnt5 / Calmodulin hücre aktivasyonunu içeren bir ara aşamasında MKH ayrışmıştır. Murin hücre dışı matris (ECM) proteini 3D kültürlerinde sferoidler filiz kabiliyetleri ile gösterildiği gibi MPCs da anjiyojenik özellikleri muhafaza. anjiyojenik potansiyeli hızla mesengenic soy boyunca MPC farklılaşma sonra kayboldu.

Burada yanlısı mevcutprotokollere‖ izole etmek ve HBM kan numunelerinden yüksek ölçüde saflaştırılmış MPCs karakterize etmek için optimize edilmiştir. MPC mesengenic ve anjiyojenik farklılaşması için tekrarlanabilir protokoller de tarif edilmiştir.

Protocol

NOT: yazılı onayı sonrasında HBM örnekleri kalça protezi için ortopedik cerrahi sırasında elde edilmiştir. Hemen heparin 500 UI içeren 20 ml şırınga oyma femur boynu osteotomisinden sonra ve femoral önce, taze BM aspire etmek için kullanılmıştır. Protokol bir dengeleme kaynağına geniş bir uygulama kabul edilir. İnsan Kemik İliği Mononükleer Hücreleri 1. İzolasyon (HBM-ÇUŞ) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (D-PBS) uygulanarak, 50 ml taze BM 10 ml ve çevirerek karıştırın – 5 seyreltilir. Aynı şekilde, iki yeni 50 ml konik tüpler 25 ml dağıtmak her tüpe D-PBS 25 ml ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. borular çözeltisi mineral kemik parçalarının ayrılması ve yağ, oda sıcaklığında 10 dakika için beklemeye bırakın. Dikkatle mineral kemik parçası pelet bozmadan 70 mikron filtreler aracılığıyla steril bir Pasteur pipeti ve filtre hücre süspansiyonu ile yüzen yağ çıkarmak. <li>, aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj için ortam, 15 ml (1.077 gr / ml) ile dört adet 50 ml tüpler ayarlayın. Bu ortam, oda sıcaklığında olduğundan emin olun. yoğunluk gradyan ortamının üstüne seyreltilmiş BM 25 ml – Yavaşça 20 yatıyordu. Karıştırma katmanları önlemek için tüp duvarları üzerinde hücre süspansiyonu damlama izin dikkatle bu işlemi gerçekleştirmek. Fren devre dışı, oda sıcaklığında, 30 dakika boyunca 400 x g'de yoğunluk gradyan santrifüjleme yapın. Steril bir Pasteur pipeti kullanarak iki faz arasında yer alan hücrelerin beyazımsı halka toplayın ve taze bir 50 ml tüp aktarın. taze kültür ortamı hücreleri yıkayın: fenol kırmızısı içermeyen, düşük glukoz (1,000 mg / L), Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) havuzlanmış insan AB tipi serumu (Phab'lar), 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler (DMEM /% 10 Phab'lar). 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. taze DMEM 10 ml /% 10 Phab'ları – Süpernatant aspire ve 5 pelet yeniden askıya. Hücre sayımı devam edin.Tripan 1 seyreltme: 1 ile beyaz kan hücrelerinin sayısını belirler. hemasitometre Bu uygulayın ve bir faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek. hücre sayısı küçük ve mükemmel yuvarlak eritrosit ve mavi boyalı ölü hücreleri hariç. NOT: Oldukça MPC kurtarma onların performansı için ekran Phab'ları toplu tavsiye edilir. Farklı kökenli en sera MSC-benzeri hücrelerin daha yüksek oranları ile MPC kültürleri ile sonuçlanırken, ABD kaynaklarından Phab'lar iyi sonuçlar vermiştir. HBM-ÇUŞ'ların gelen MPCs 2. izolasyonu Eden taze DMEM /% 10 Phab'lar 15 ml hidrofobik, T-75 balonları ayarlama ve pH ve sıcaklık 30 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de ön-kuluçkalama ile denge sağlar. Tohum 4 – şişesi başına 6 x 10 7 HBM-uluslu şirketlerin ve 48 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin. Aspire edin ve kaplardan olan ve yapışmayan hücreler atılır. eden taze DMEM /% 10 Phab'lar 15 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe% 5 CO 2. ORTA her 48 saat değişen 8 gün – 6 kültürleri korumak. İSTEĞE BAĞLI: MPC veriminin arttırılması için, 2.3 yapışmayan hücreler yeni bir kültür şişesi içinde yeniden kaplanmış ve primer kültürlerin için tarif edildiği gibi korunabilir. Aspire ve şişeler orta atmak taze DMEM ile yıkayın ve çözüm ayırma hayvan serbest proteaz 2 ml ekleyin. 15 dakika boyunca (uzun kuluçka kaçının) – 5 37 ° C'de inkübe edin. 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu ve santrifüj taze DMEM /% 10 Phab'lar 10 ml ilave edilir ve aspire Aspire ve supernatant atın ve 1 pelet yeniden askıya – taze DMEM 2 ml /% 10 Phab'ları. Adım 1.10 açıklandığı gibi hücre sayısında geçin. NOT: ayıraç ayırma olarak tripsin / EDTA kullanmayın. PPM'lerin dirençli tripsin. kültürlerin morfolojik tarama hücre hasat öncesi, yüksek iğ şeklinde MSC-benzeri hücrelerin varlığını değerlendirmek için tavsiye edilir. MSC benzeri hücrelerin durumda önemli miktarda d vardıretected seçici kontamine hücreleri yok ederek hücre ürününün saflığını artırmak. Bunu yapmak için, bir şekilde tripsin emdirme 2 dakika boyunca tripsin 2 ml / EDTA,% 0.05 ilave ederek, MPC hasat öncesinde gerçekleştirilebilir. Yıkama kültürler iki kez DMEM /% 10 Phab'lar 5 ml, daha sonra yukarıdaki gibi tedavi proteaz geçin. 3. Hücre Karakterizasyonu Akış sitometrisi Yıkama çözeltisi içinde 10 5, taze müstakil hücrelerin benzer örneklerin ayarlayın: D-PBS% 0.5 (h / h) inek serumu albümini (BSA) ve% 0.02 (ağ / hac) sodyum azid ile takviye edilmiştir. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Yıkama çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya ve anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 ve floresan boyalar ( "test") ile konjuge edilmiş anti-CD31 antikor ekleyin; paralel izotip kontrolleri ( "CTRL") kurdu. NOT: antikorları boyama miktarları titrasyon veya edi tarafından belirlenmelidirüreticinin talimatlarına artırılabilir. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Yıkama solüsyonu 500 ul hücreleri yeniden askıya ve 7 9 10 sitometresinde renkli akış en az 5 x 10 4 olayları kazanır. nokta-araziler ile sonuçlarını analiz ve kadran ayarlamak için "CTRL" kaydedilmiş olayları kullanın. NOT: MPC kültür olarak kültür tanımlamak amacıyla CD73 negatif CD90 negatif CD45 + CD31 + hücrelerin yüzdesi% 95 üzerinde olmalıdır. % 98 – bazı özel uygulamalar için, örneğin, gen ekspresyon analizi, geri kesme 97 arttırılmalıdır. Nestin algılama ve F-aktin organizasyon analizi Kültür oda slaytlar levhalar taze izole edilmiş MPCs (20,000 / cm2). Hücreler,% 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe etmek suretiyle uygun izin verin. yıkama solüsyonu ve fi hücreleri yıkayın% 4 x 15 dakika için oda sıcaklığında (ağırlık / hacim), para-formaldehid. sabitleştirici, yıkama solüsyonu ilave 2 dakika boyunca inkübe ve dökün kaldırmak için. iki kez yıkama tekrarlayın. D-PBS içinde geçirgenliği hücreler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.05 (h / h) Triton X-100 ile takviye edilmiştir. proteinsiz sinyal arttırıcı (oda sıcaklığında 30 dakika) ya da standart engelleme çözeltisi ile reaksiyonu durdurun (D-PBS% 3 ile desteklenmiş (w / v) BSA). çözümü engelleme / sinyal arttırıcı çıkarın. 7 ug / ml ilave anti-insan Nestin birincil antikor (a / h) ile nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Buna paralel olarak, değil özel floresan sinyalleri değerlendirmek için izotipik kontrol antikorları kullanın. D-PBS ekleyerek slaytlar yıkayın, 2 dakika bekletin ve dökün. İki kez tekrarlayın. 2 ug / ml ilave fluoresan boya konjuge sekonder antikor (a / h) ve karanlıkta 1 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin. Yıkama yukarıda kayar. Floresan phalloidin (5 UI / ml) ilave, 30 m, oda sıcaklığında bırakınve karanlıkta D-PBS içinde 3 kere yıkayın. odası duvarları kaldırmak ve çekirdekler tespiti için antifade reaktif ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile desteklenmiş, sulu yapıştırma vasatı içerisinde montaj slaydları. 7 9 10 görüntüleme geçin. MPCs 4. Mesengenic Farklılaşma Levha 2 x 10 4 / cm2 TC-muamele T75 kültür şişelerinde taze izole edilmiş MPCs ve hücreler,% 5 CO2 içinde 37 ° C de DMEM /% 10 Phab'lar gece boyunca uygun bildirin. Mezenkimal stromal hücre genişlemesi (MSC-SC ortamı) için tasarlanmış, standart düşük serum ortamı, yaklaşık 200 ul / cm2, DMEM /% 10 Phab'lar değiştirin. indüksiyon 7 ila 10 gün arasında, tipik olarak, (P1-mezenkimal) konflüansa hücreleri büyütün. 2 günde orta yenileyin. Aspire ve şişeler orta atmak taze MSC-RS ortamı ile yıkayın ve çözüm ayırma hayvan serbest proteaz 2 ml ekleyin. 37 ° C'de inkübe edin76, 5 C – 15 dakika (uzun kuluçka kaçının). 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu ve santrifüj taze MSC-SC ortamı 10 ml aspire Taze MSC-RS orta 2 ml – Süpernatant aspire ve 1 pelet yeniden askıya. Adım 1.10 açıklandığı gibi hücre sayısında geçin 5 x 10 3 hücre / cm 2-3 ekim onlara alt kültüre devam edin. (P2-MKH'lerin) izdiham hücreleri büyür. 4.5 adım ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi karakterize devam etmek için aşama 4.3 altında tarif edildiği gibi bir proteaz sindirimi ile Hasat hücreleri. Not: CD73 + CD90 + CD45 negatif CD31 negatif hücrelerin yüzdesi daha düşük% 95, sadece kısmi türev gösterir ve ayrıca bir kültür geçişi gerektirecektir. Levha P2-MSC'ler 2 x altı kuyucuklu TC ile tedavi edilmiş plakalarda, 10 4 / cm2 ve büyümesi de MSC-SC ortamı içinde birikene kadar. Mark "Hayır Diff" olarak iki kuyu ve MSC-RS orta yenileyin. Mark iki iyi"Osteo" ve özellikle MSC farklılaşması için tasarlanmış 200 ul / standart osteojenik ortamın cm 2 ile orta yerine kadar s. Mark iki "Adipo" olarak kuyu ve özellikle MSC farklılaşması için tasarlanmış 200 ul / standart adipogenic ortamın cm 2 ile orta yerine. Bütün ortam maddesi her 48 saat değiştirerek% 5 CO2 içinde 37 ° C'de kültürler koruyun. NOT: Bu son derece Test tekrarlanabilir standart piyasada mevcut ayırt medyayı kullanılması tavsiye edilir. hücre içi lipid damlacıkları birikimi adipogenic kaynaklı hücrelerde belirgin iken ayırt şartlarda 2/3 hafta sonra, kireçlenme, osteojenik kaynaklı kültürlerde görülür. Aspire kültür ortamı daha sonra D-PBS ile yıkayın atmak ve. Oda sıcaklığında 15 dakika için para-formaldehid (ağ / hac)% 4, 1 ml ekleyerek kültürleri sabitleyin. sabitleştirici, D-PBS ekleyin 2 dakika boyunca inkübe ve dökün kaldırmak için. Tekrarlama yıkamaiki kez. İki "Adipo" 200 nM Nil Kırmızı çözelti kuyular işaretli iki "Osteo" birlikte hidroksiapatit özel floresan çözüm ve bir "Hayır Diff" kuyular işaretli birlikte bir "Hayır Diff" Leke. Oda sıcaklığında 11,12, 30 dakika süreyle inkübe edilir. çözümler boyama çıkarın ve iki kez D-PBS içinde yıkayın. Ekleme, D-PBS çıkarın D-PBS% 50 (h / h) gliserin ile takviye edilmiş ve görüntüleme 7 9 10 geçin. 5. MPC Sfero çimlenme Deneyi 3D parçacıklarının üretilmesi için bir petri çanağı kapağın iç yüzeyi üzerinde yeni izole edilmiş MPC süspansiyonu (1.5 x 10 4 hücre / damla) 20 ul damla yatmaktadır. NOT: taşıma damla kendi yırtılmasına yol açabilir gibi, fazla bırakmaya son derece tavsiye ediyoruz. Dikkatle D-PBS asılı buharlaşmasını damla önlemek için içeren bir Petri kabı tekrarlamak için kapağı kullanın. CO2,% 5 37 ° C'de inkübe edinbir gecede hücreler 3D küresellerde agrega için izin vermek. önceden soğutulmuş 24 oyuklu bir kültür plakasına standart ECM proteinlerinin 300 ul hacimde eklenmesiyle murin hücre dışı matris (ECM) bir protein kalın bir jel ayarlama, ve 30 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin. Dikkatle Petri kabı kapağı devrilebilir ve yavaşça steril bir Pasteur pipeti kullanarak parçacıklarının pick up. ECM proteini jel üzerine parçacıklarının Lay standart VEGF zengin endotelyal hücre büyüme ortamı 700 ul alikotları ekleyin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin. 24 saat sonra ve kültür 7 gün, 4X büyütme gücü 3D kültürlerin fotoğraf çekmek. Son istilacı hücre ve sfero kenarı arasındaki radyal mesafe ölçülerek görüntü analiz yazılımı uygulayan sferoidler çimlenme değerlendirin. en az 20 farklı yönleri boyunca tekrar ölçer. Ortalama mesafe ne zaman 50 mikron ya da üzerinde olumlu olarak kabul edilir.

Representative Results

Burada tarif edilen seçici kültür koşulları HBM-çok uluslu% 1.0 bir roman yapışık ve hemen hemen monomorfik hücre popülasyonu izole izin (0,5-2,0 x 10 5 6 HBM-uluslu şirketlerin – taze BM numuneleri, 10 ml) 5,6 . MPCs 5 gibi, hareketsiz, Ki-67-pozitif hücrelerin bulunduğu yuvarlak, – bu büyük (60 um çapında 40) tespit edilmiştir. Morfolojik olarak, bunlar (Şekil 1 A.1 beyaz oklar) daha yüksek bir büyütme güçte filopodia çok gösteren düz, ince çevre ile çevrelenmiş kalın çekirdek bölge ile ayırt edici bir kızarmış yumurta-şeklinde karakterize edilir. Dış hücre sınır Polar uzama genellikle (Şekil 1 A.1 siyah oklar) görülmektedir. Bu morfoloji, standart MSC kültürlerinde rapor tipik iğ şekilli mezenkimal stromal hücre görünüşünden açıkça farklıdır. Akım sitometri m iken CD31 ve CD45 ifade taze izole MPCs% 95 in üzerinde gösterdiesenchymal ilişkili markörler CD90 ve CD73 13 tespit edilemeyen (Şekil 1 A.2) idi. Biz MPCs için dört antijenlerin bu sınırlı kümesi olarak gösterge görüyoruz. MPCs daha ayırt edici özellikleri hücrelerde algılanmaz (Şekil 1 A.3'te kırmızı) bir podosome benzeri yapıların sayısını ortaya noktalı F-aktin dağıtım ve Nestin yoğun anlatım (Şekil 1 A.3'te yeşil) vardır izotipik kontrol antikoru ile lekelenmiş (veriler gösterilmemiştir). Standart RS Kültürleme MPCs orta katlanarak büyüyen MSC-benzeri hücreler (Şekil 1 B.1) içine hızlı farklılaşma MSC genişleme sonuçları için tasarlanmış. Iki geçit sonra hücreler nihayet CD73 + CD90 + CD45 negatif CD31 neg (Şekil 1 B.2) için CD73 negatif CD90 negatif CD45 + CD31 + 'dan kendi fenotip geçiş. Bu süreç içinde, PPM'ler yeniden azotaNestin ifade Birkaç nadir hücreleri (Şekil 1 B.3) sınırlı olur ise nize stres liflerinin içine F-aktin. kesin MSC gibi fenotip içine MPC mesengenic farklılaşma farklı hücre morfolojileri ortaya iki farklı adımlar sayesinde gerçekleşir. MSC SC ortamı içinde bir hafta MPC-benzeri hücrelerin bir artık doldurma işleminden sonra halen (Şekil 2, bir P1-MSC), düz, poligonal, çok dallı hücrelerinin konfluent tabaka içinde tespit edilebilir. Başka bir kanala (Şekil 2, bir P2-MSC) iğsi MSC-benzeri hücrelerin neredeyse monomorfik kültür elde etmek için gereklidir. böylece MSC doğasını teyit en az 2 hafta boyunca seçici ortama aktarıldığında bu katlanarak büyüyen hücreler kolayca osteoblast veya adipositlere ayırt edebilirsiniz. Osteojenik kaynaklı kültürlerde, kireçlenme, ya kolorimetrik Alizarin-S leke ya da belirli bir floresan boyalar (Şekil 2 B yeşil) ile tespit edilebilir. adipojenik endüksiyon sonra hücreler(Şekil 2 B kırmızı) ya kolorimetrik Yağ Kırmızı veya floresan Nil Kırmızı leke ortaya lipid damlacığı birikimi gösterir. MPC yazarak anjiyojenez deneyi filizlenme ile teyit edilmiştir. PPM'ler 24 saat VEGF-uyarıcı (Şekil 2 C) sonra 3D sferoidlerde gelen fare ECM protein jel istila (mikron 50) yeteneğini gösterdi. 600 mikron mesafe – Bir hafta hücreleri istila 300 tespit edildikten sonra. Tersine, işgal kapasitesi mesengenic farklılaşma (Şekil 2 D) sonra P2-MKH kayboldu. Şekil 1. Taze İzole MPCs Belirgin Özellikler var. DMEM /% 10 Phab'ları içinde Kültüre HBM-ÇUŞ'larına yedi gün boyunca MKH kolayca ayırt sakin MPCs (A) nüfusu (B) yol açar </strong> morfoloji açısından (A.1, B.1, ölçek çubukları = 100 mikron), fenotip (A.2, B.2), F-aktin dağılımı (A.3'te kırmızı, B.3), ve Nestin ifade (A.3, B.3'te yeşil, ölçek çubuklar 20 mikron =). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 2. MPCs orta MSC genişlemesi için tasarlanmış ticari olarak mevcut RS DMEM / Phab'ları in vitro. Değiştirme Standart MKH ve Show çimlenme Angiogenezis içine ayırt Şekil MPCs mesengenic indüksiyon tetikler. Kültür için tek bir hafta sonra bir kaç artık MPCs de MSC-SC ortamı içinde bir başka geçiş birleşik MSC-benzeri hücre popülasyonu (P2-MSC'ler, bir ölçek bar = 100 um) neden olurken, saptanabilir (P1-MSC'ler) vardır. PKalsiyum birikimi (B yeşil) ve lipid damlacığı birikimi (B kırmızı, ölçek çubukları = 200 mikron) gösterdiğine göre 2-MKH ölümcül sırasıyla, uygun uyaranların altında osteosit veya adipositler içine ayırt. MPCs P2-MSC (D, ölçek çubukları = 1,0 mm) bir farkı fare ECM proteini jel (C) sferoidler tutarlı filizlenme gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity16, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation.

Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in “crude” and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)2. Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.

A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation21. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum6. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.

MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported9 would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions.

It is not clear if these “contaminating” MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow22 or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.

Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation7. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as “Mesangiogenic Progenitor Cells”, maintaining the acronym MPCs.

We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages23.

Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, özellikle kemik iliği örnekleri ve insan osteo-ataları onun uzmanlık sağlamak için, Dr. Paolo Parchi, Cerrahi bölümü, Tıp ve Moleküler Patoloji ve Yoğun Bakım Tıbbı, Pisa Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum

Materials

Matrigel Basement Membrane Matrix BD Bioscience (San Jose, CA-USA) 354230 Murine ECM proteins
Stock Concentration: 100% (9-12 mg/ml)
Final Concentration: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) Sigma (St. Louis, MO, USA) D8537
70 μm Filters Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany) 130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM  GE Healthcare (Uppsala, Sweden) 17-5442-03 medium for discontinuos density gradient centrifugation
Pooled human AB type serum (PhABS) LONZA (Walkersville MD-USA) 14-490E Final Concentration: 10%
Glutamax-I ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 35050-038 Stabilized L-Glutamine
Stock Concentration: 100X
Final Concentration: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma (St. Louis, MO, USA) A8412 Stock Concentration: 7.5%
Final Concentration: 0.5%
Sodium Azide Sigma (St. Louis, MO, USA) S8032 Final Concentration: 0.02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep) Gibco (Grand Island, NY, USA) 15070-063 Antibiotics
Stock Concentration: 5,000 UI/mL penicillin, 5,000 ug/mL Streptomycin
Final Concentration: 50 UI/mL penicillin, 50 ug/mL Streptomycin
T-75 culture flask for suspension cultures Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany) 658 190
T-75 culture flask TC treated Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany) 658170
TrypLE Select ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 12563-011 Animal- free proteases detaching solution
Stock Concentration: 1X
Final Concentration: 1X
Trypsin/EDTA ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 15400-054 Phenol red free
Stock Concentration: 0.5%
Final Concentration: 0.25%
anti-CD90 APC antibody  (CD90) MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-095-402 Final Concentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45) MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-096-609 Final Concentration: 1:40
anti-CD73 PE antibody (CD73) MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-095-182 Final Concentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31) MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-105-260 Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 APC antibody MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-098-846 Final Concentration: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antibody MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-096-637 Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE antibody MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-098-845 Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-098-563 Final Concentration: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM) ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 13-1331-82 Phenol red-free minimal essential medium
Stock Concentration: 1'000 mg/l glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS) ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 10500 Stock Concentration:0.2 mg/mL
Final Concentration: 2 μg/mL
Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole Invitrogen (Waltham, MA,  USA) P-36931 Aqueous mounting medium + DAPI
Final Concentration: 1X
Paraformaldehyde Sigma (St. Louis, MO, USA) P6148 Fixative
Final Concentration: 4%
LAB-TEK two-well chamber slides Sigma (St. Louis, MO, USA) C6682
Anti-Nestin antibody [clone 10C2] Abcam (Cambridge, UK) ab2035 Stock Concentration: 1 mg/ml
Final Concentration: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin ThermoFisher (Waltham,  MA USA) A34055 Stock Concentration: 200 UI/ml
Final Concentration: 5 UI/ml
Triton X-100 Euroclone (Milan, Italy) EMR237500 Final Concentration: '0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium) ThermoFisher (Waltham,  MA USA) 12746-012
Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit ThermoFisher (Waltham,  MA USA) A31619 Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer
Stock Concentration: 2 mg/ml
Final Concentration: 2 μg/ml
Pasteur Pipette Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY ) 329
StemMACS AdipoDiff  Media MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) 130-091-678
Osteoimage Bone mineralization Assay LONZA (Walkersville MD-USA) PA-1503 Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution
50mL Polystyrene conical tube Greiner bio-one (Kremsmünster
Austria)
227261
Nile Red ThermoFisher (Waltham,  MA USA) N1142 Fluorescent staining solution for lipids
Stock Concentration: 100 mM
Final Concentration: 200 Nm
Glycerin Sigma (St. Louis, MO, USA) G2289 Final Concentration: '50%
Polistirene Petri dishes Sigma (St. Louis, MO, USA) P5606
24-well plates TC-treated Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany) 662160
Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2) LONZA (Walkersville MD-USA) CC-3162 VEGF-rich endothelial cell growth medium
Leica Qwin Image Analisys Software Leica (Wetzlar, Germany) Image analysis software

References

  1. Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).
  2. Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).
  3. Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
  4. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
  5. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  6. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  7. Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).
  8. Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
  9. Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).
  10. Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
  11. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  12. Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
  13. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  14. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
  15. Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
  16. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  17. Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
  18. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  19. Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
  20. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  21. Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
  22. Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).
  23. Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).

Play Video

Cite This Article
Montali, M., Barachini, S., Pacini, S., Panvini, F. M., Petrini, M. Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54225, doi:10.3791/54225 (2016).

View Video