Isolations Mesangiogenic stamceller (MPC) från human benmärg

Summary

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Abstract

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as “Mesangiogenic Progenitor Cells”.

Introduction

Mesenkymala stromaceller celler (MSC) är relevant kliniskt värde för deras flera härstamning differentiering kapacitet och deras förmåga att stödja hemopoiesis, att utsöndra tillväxtfaktorer / cytokiner samt att spela en roll i immun ^en. I definitionen av MSC-baserad produktion och tillämpning cellterapi har varit föremål för omfattande klinisk och preklinisk forskning ^2, med särskild hänsyn till specifik internationell reglering för säkerhet och effekt av cellbaserade läkemedel för (CBMP) behandlingar ^3. Humana MSC: er är i stor utsträckning odlas i media innehållande kosttillskott och reagens av animaliskt ursprung, såsom fetalt bovint serum (FBS) och bovint trypsin. Därför, tillsammans med infektions risker som är förknippade med cellmanipulering patienter också inför prionexponering samt immunologiska risker som är kopplade till proteiner, peptider eller andra biomolekyler av animaliskt ursprung som kan kvarstå efter cellskördning och Transplanförandet ^4.

För att kringgå problemet, odlade vi human benmärg (HBM) härledda MSC i djurfritt medium, som ersätter FBS med sammanslaget humant AB typ serum (PhAbs). Under dessa betingelser, vid sidan av växande MSCs vi identifierat en ny cellpopulationen. Dessa celler var morfologiskt och fenotypiskt skild från MSC: er och visade en distinkt genuttryck profil samt karaktäristiska växande / vidhäftningsegenskaper. De behöll både mesengenic och angiogena potential och därför nämndes mesodermala stamceller (MPC) ^5. Därefter kunde vi definiera selektiva och reproducerbara odlingsbetingelser för att generera partnerländerna i hög grad av renhet ^sex.

Vi undersökte vidare morfologiska och biologiska egenskaperna hos Medelhavsländerna. Medelhavsländerna visade sig vara nestin-positiva, långsam i cykling, Ki-67-negativa, och med kromosomer som kännetecknas av långa telomerer ^5. De uttryckte pluripotency-associerade transkriptionsfaktorer oktober-4 och Nanog snarare än MSC master- regulatorer Runx2 och Sox9 ^7. Fenotypiskt, Medelhavsländerna uttryckte endoglin (CD105) på lägre nivå än MSCs samtidigt saknar mesenkymala markörer CD73, CD90, CD166. MPCs visade också ett distinkt mönster av adhesionsmolekyler som kännetecknas av konsekvent uttryck av PECAM (CD31), integriner αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) samt grin β2 (CD18) som specifikt sustains podosome liknande strukturer ⁸ . I standard MSC expansionsmedier, Medelhavsländerna snabbt differentieras till MSC genom ett mellansteg med aktiveringen av Wnt5 / Calmodulin cell signalering ^9. MPCs behöll också angiogena egenskaper, vilket framgår av deras förmåga att gro från sfäroider i murina extracellulär matrix (ECM) protein 3D kulturer. Den angiogena potentialen snabbt förlorade efter MPC differentiering längs mesengenic härstamning.

Här presenterar vi protokoler optimerats för att isolera och karakterisera högrenade partnerländerna från HBM blodprov. Reproducerbara protokoll för MPC mesengenic och angiogena differentiering beskrivs också.

Protocol

OBS: Efter skriftligt medgivande, var HBM prover under ortopedisk kirurgi för höftledsplastik. Omedelbart efter lårbenshals osteotomi och innan lårbens brotschning en 20 ml spruta innehållande 500 UI av heparin, användes för att aspirera färsk BM. Protokollet skall betraktas allmänt tillämpas på alla BM källa. 1. Isolering av human benmärg mononukleära celler (HBM-MNC) Späd 5 – 10 ml av färskt BM till 50 ml, med tillämpning Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) och blanda genom inversion. Lika distribuera 25 ml i två nya 50 ml koniska rör, tillsätt 25 ml D-PBS till varje rör och blanda genom inversion. Tillåta rören stå i 10 min vid rumstemperatur, för separation av mineral benfragment och fett från lösning. Försiktigt bort flytande fett med en steril pasteurpipett och filter cellsuspensionen genom 70 um filter utan att störa mineral benfragmentet pellet. <li> Ange fyra 50 ml rör med 15 ml av medium för diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering (1,077 g / ml). Se till att detta medium är vid rumstemperatur. Lägg försiktigt 20 – 25 ml utspädd BM ovanpå densitetsgradient medium. Utför denna operation noggrant och låter cellsuspensionen trickle på rörväggarna att förhindra blandning lager. Utföra densitetsgradient centrifugering vid 400 xg under 30 min vid rumstemperatur med bromsen stängts av. Samla vitaktig ring av celler som ligger mellan de två faserna med hjälp av en steril pasteurpipett och överföra det till ett nytt 50 ml rör. Tvätta cellerna med färskt odlingsmedium: fenolrött-fritt, låg glukos (1000 mg / l) Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (volym / volym) poolat humant AB-typ serum (PhAbs), 2 mM L-glutamin och antibiotika (DMEM / 10% PhAbs). Centrifugera vid 400 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5-10 ml av färsk DMEM / 10% PhAbs. Fortsätt till celltal.Bestäm antalet vita blodkroppar med 1: 1 utspädning i trypan. Tillämpa detta på den hemocytometer, och observera under ett faskontrastmikroskop. Undanta små och perfekt rundade erytrocyter och blåfärgade döda celler från cellantalet. OBS: Det rekommenderas att skärm PhAbs partier för sina prestationer i MPC återhämtning. PhAbs från USA källor har gett bäst resultat medan de flesta sera från olika ursprung resulterade i MPC kulturer med högre halter av MSC-liknande celler. 2. Isolering av Medelhavsländerna från HBM-MNC Ställa hydrofoba T-75-kolvar med 15 ml nytt DMEM / 10% Phab-partiklar och låt pH och temperatur jämvikt genom för-inkubering vid 37 ° C i 5% CO2 under 30 min. Seed 4-6 x 10 7 HBM-MNC per kolv och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 48 timmar. Aspirera och kasta medium och icke vidhäftande celler från kolvarna. Tillsätt 15 ml av färsk DMEM / 10% Phab-partiklar och inkubera vid 37 ° Ci 5% CO2. Bibehålla kulturer för 6 – 8 dagar, ändra mediet var 48 timmar. EXTRA: För att öka MPC avkastning, icke-vidhäftande celler från 2,3 kunde åter pläterad i en ny odlingskolv och underhållas som beskrivits för primära kulturer. Aspirera och kassera medium från flaskor, tvätta med färsk DMEM och tillsätt 2 ml av animaliskt fri proteas loss lösning. Inkubera vid 37 ° C under 5 till 15 min (undvika långvarig inkubation). Tillsätt 10 ml av färsk DMEM / 10% PhAbs, aspirera cellsuspensionen och centrifugera vid 400 xg under 5 minuter Aspirera och kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 – 2 ml färsk DMEM / 10% PhAbs. Fortsätt till cellräkning såsom beskrivs i steg 1,10. OBS: Använd inte trypsin / EDTA som loss reagens. Medelhavsländerna är trypsin resistenta. Morfologisk screening av kulturerna, före cellskörd, rekommenderas starkt för att utvärdera förekomsten av spolformad MSC-liknande celler. Vid avsevärd mängd MSC-liknande celler detected, öka renheten av den cellprodukt genom att selektivt avlägsna de kontaminerade cellerna. För att göra detta, kan trypsin matsmältningen utföras före MPC skörd, genom att tillsätta 2 ml trypsin / EDTA 0,05% under 2 minuter. Tvätta kulturer två gånger med 5 ml DMEM / 10% PhAbs, sedan vidare till proteas behandling enligt ovan. 3. Cell Karakterisering Flödescytometri Inrättat duplikatprov av 10 5 färsk lösgjorda celler i tvättlösning: D-PBS kompletterad med 0,5% (volym / volym) bovint serumalbumin (BSA) och 0,02% (vikt / volym) natriumazid. Centrifugera vid 400 xg under 5 min. VARNING: Natriumazid är giftigt. Återsuspendera pellets i 200 pl tvättlösning och tillsätt anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 och anti-CD31-antikroppar konjugerade med fluorescerande färgämnen ( "Test"); parallellt inrätta isotypkontrollerna ( "CTRL"). OBS: Mängder av färgning antikroppar bör bestämmas genom titrering eller enligding tillverkarens instruktioner. Inkubera proverna vid 4 ° C under 30 minuter. Centrifugera vid 400 xg under 5 min. Återsuspendera cellerna i 500 pl tvättlösning och skaffa minst 5 x 10 4 händelser multi flödescytometer 7 9 10. Analysera resultat med prick tomter och använda "Ctrl" inspelade händelser att ställa kvadranter. OBS: För att definiera kulturen som MPC kultur andelen CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + celler bör vara över 95%. För vissa specifika tillämpningar, dvs, har genuttrycksanalys återställningsbryt ökas till 97-98%. Nestin detektering och F-aktin organisation analys Plate nyisolerade Medelhavsländerna på kulturkammarobjektglas (20000 / cm2). Tillåta cellerna att vidhäfta genom inkubation över natt vid 37 ° C i 5% CO2. Tvätta cellerna i tvättlösning och fix i 4% (vikt / volym) paraformaldehyd vid rumstemperatur under 15 min. För att ta bort fixativ lägga tvättlösning, inkubera under 2 min och häll. Upprepa tvättningen två gånger. Permeabilize celler i D-PBS kompletterad med 0,05% (volym / volym) Triton X-100 under 15 min vid RT. Stoppa reaktionen genom proteinfritt signalförstärkare (30 min vid RT) eller standardblockeringslösning (D-PBS kompletterad med 3% (vikt / volym) BSA). Ta bort signalförstärkare / blockeringslösning. Lägga 7 | ig / ml (vikt / volym) av anti-human nestin primär antikropp och inkubera vid 4 ° C över natten i en fuktig kammare. Parallellt använda isotypisk kontroll antikroppar för att utvärdera inte specifika fluorescenssignaler. Tvätta diabilder genom att tillsätta D-PBS, låt stå i 2 minuter och häll. Upprepa två gånger. Lägg 2 | ig / ml (vikt / volym) av fluorescerande färgämne konjugerad sekundär antikropp och inkubera vid 4 ° C under 1 h i mörker. Tvätta objektglasen enligt ovan. Lägg fluorescerande Phalloidin (5 UI / ml), lämnar vid RT under 30 mi i mörker och tvätta 3 gånger i D-PBS. Ta kammarväggarna och montera bilder i vattenmonteringsmedium kompletterat med antifade reagens och 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för kärnor upptäckt. Fortsätt att avbilda 7 9 10. 4. Mesengenic Differentiering av Medelhavsländerna Plate 2 x 10 4 / cm2 nyisolerade partnerländerna i TC-behandlade T75 odlingsflaskor och låta cellerna vidhäfta över natten i DMEM / 10% PhAbs vid 37 ° C i 5% CO2. Byt DMEM / 10% PhAbs med standard reducerat serummedium, cirka 200 l / cm2, utformad för expansion mesenkymala stromaceller (MSC-RS-medium). Odla celler till sammanflytning (P1-MSC: er), typiskt från 7 till 10 dagar från och med induktion. Uppdatera medium var 2 dagar. Aspirera och kassera medium från flaskor, tvätta med färsk MSC-RS-medium och tillsätt 2 ml av animaliskt fri proteas loss lösning. Inkubera vid 3776; C under 5 – 15 min (undvika långvarig inkubation). Tillsätt 10 ml av färsk MSC-RS medium aspirera cellsuspensionen och centrifugera vid 400 xg under 5 minuter Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 – 2 ml färsk MSC-RS-medium. Fortsätt till cellräkning som beskrivs i steg 1,10 Fortsätt till subkultur dem genom att så 3-5 x 10 3 celler / cm 2. Odla celler till sammanflytning (P2-MSC: er). Harvest celler genom proteas matsmältningen som beskrivs från steg 4,3 till steg 4,5 och fortsätt till karakterisering som beskrivs i avsnitt 3. OBS: En del av CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg celler lägre än 95% skulle indikera endast delvis differentiering och kräva ytterligare kultur passage. Plåten P2-MSCs på 2 x 10 4 / cm 2 i sex väl TC-behandlade plattor och växa till konfluens i MSC-RS-medium. Markera två brunnar som "Ingen Diff" och uppdatera MSC-RS-medium. Mark två väls som "Osteo" och ersätt medium med 200 l / cm2 av standardmässig osteogen medium, särskilt utformade för MSC-differentiering. Markera två brunnar som "Adipo" och ersätta mediet med 200 ul / cm2 standard adipogena medium, särskilt utformade för MSC-differentiering. Bibehålla kulturer vid 37 ° C i 5% CO2 genom att ändra de hela media varje 48 h. OBS: Det rekommenderas att använda standard kommersiellt tillgängliga differentiering media för prov reproducerbarhet. Efter 2/3 veckor under differentierande förhållanden, kalkavlagringar visas i osteogena inducerade kulturer, medan intracellulära lipiddropparna ackumulering är uppenbar i adipogena inducerade celler. Aspirera och kassera odlingsmedia tvätta sedan med D-PBS. Fixera kulturerna genom att tillsätta 1 ml av 4% (vikt / volym) para-formaldehyd under 15 min vid rumstemperatur. För att ta bort fixerings lägga D-PBS, inkubera i 2 minuter och häll. Upprepa tvättningendubbelt. Färga en "No Diff" tillsammans med de två "Osteo" märkta brunnar i hydroxyapatit specifik fluorescerande lösning och en "No Diff" tillsammans med de två "Adipo" märkta brunnar i 200 nM Nile Red lösning. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur 11,12. Ta färgning lösningar och tvätta i D-PBS två gånger. Ta bort D-PBS, tillsätt D-PBS supplementerat med 50% (volym / volym) glycerol och fortsätt till avbildning 7 9 10. 5. MPC Spheroid Sprouting Assay För att producera 3D-sfäroider, låg 20 | il droppar av nyligen isolerade MPC-suspension (1,5 x 10 4 celler / droppe) på den inre ytan av en Petri-skål lock. OBS: Som hanterings droppar kan leda till deras brott, är det mycket tillråda att lägga dem i överskott. Använd försiktigt locket för att sammanfatta en petriskål med D-PBS för att förhindra hängande droppar avdunstning. Inkubera vid 37 ° C i 5% CO2över natten för att tillåta celler att aggregera i 3D sfäroider. Ställa in en tjock gel av murina extracellulära matrisen (ECM) proteiner genom att tillsätta 300 | il alikvoter av standard ECM-proteiner i en förut kyld 24-brunnars odlingsplatta, och inkubera vid 37 ° C under 30 min. tippa försiktigt över skålen locket Petri och försiktigt plocka upp sfäroiderna med hjälp av en steril pasteurpipett. Låg sfäroider på ECM proteingel, tillsätt 700 | il alikvoter av standard VEGF-rika endotelial celltillväxtmedium och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2. Efter 24 timmar och vid 7 dagars odling ta bilder av 3D-kulturer vid 4X förstoringen. Utvärdera groning från sfäroider som tillämpar bildanalysmjukvara genom att mäta det radiella avståndet mellan sista invaderande cellen och den sfäroid kanten. Kommande åtgärder längs åtminstone 20 olika riktningar. Medeldistans bedöms som positivt då 50 pm eller över.

Representative Results

De selektiva odlingsbetingelser som beskrivs här har möjliggjort isolering av en ny vidhäftande och nästan monomorf cellpopulation som 1,0% av HBM-MNC (0,5 – 2,0 x 10 6 HBM-multinationella företag från 5 – 10 ml av färska BM prover) 5,6 . Vi identifierade dessa stora (40-60 pm i diameter), rundade, vilande, Ki-67-negativa celler som Medelhavsländerna 5. Morfologiskt kännetecknas de av en distinkt stekt ägg-form med ett tjockt kärnregion omgiven av en platt tunn periferin visar massor av filopodia vid högre förstoring effekt (vita pilar i Figur 1 A.1). Polar förlängning av det yttre cellgräns observeras ofta (svarta pilar i figur 1 A.1). En sådan morfologi är klart skiljer sig från den typiska spolformad mesenkymala stromaceller utseende redovisas i standard MSC kulturer. Flödescytometri visade över 95% av nyisolerade Medelhavsländerna att uttrycka CD31 och CD45 medan mesenchymal associerade markörer CD90 och CD73 13 var odetekterbara (Figur 1 A.2). Vi betraktar detta begränsad uppsättning av fyra antigener som vägledande för MPC. Ytterligare särskiljande särdrag hos MPCs är prickade F-aktin fördelning avslöjar ett antal podosome liknande strukturer (röd i figur 1 A.3) och intensiva uttryck av nestin (grön i figur 1 A.3), som inte detekteras i cellerna färgades med isotypiska kontrollantikroppen (data ej visade). Odling Medelhavsländerna i standard RS-medium avsedd för MSC expansionsresulterar i snabb differentiering till exponentiellt växande MSC-liknande celler (Figur 1 B.1). Efter två passager celler växla slutligen sin fenotyp från CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + till CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (Figur 1 B.2). I processen, partnerländerna åter organize F-aktin i spännings fibrer medan nestin uttryck blir begränsad till några få celler (Figur 1 B.3). MPC mesengenic differentiering till en bestämd MSC-liknande fenotyp sker genom två distinkta steg avslöjas av olika cell morfologier. Efter en vecka i MSC RS-medium en rest population av MPC-liknande celler är fortfarande detekteras i ett sammanhängande lager av platta, polygonala multi-grenade celler (P1-MSC i figur 2 A). En ytterligare passage krävs för att erhålla en nästan monomorf kultur av spolformad MSC-liknande celler (P2-MSC: er i figur 2 A). Dessa exponentiellt växande celler kan lätt differentieras till osteoblaster eller adipocyter när de överförs till selektivt medium under minst 2 veckor, vilket bekräftar deras MSC natur. I osteogena inducerade kulturer, kan kalkavlagringar detekteras genom antingen kolorimetrisk Alizarin-S fläck eller specifika fluorescerande färgämnen (gröna i Figur 2 B). Efter adipogena induktions cellervisa lipiddroppe ackumulering vilket framgår av antingen kolorimetrisk Oil Red eller fluorescerande Nile röd fläck (röd i figur 2 B). MPC typning bekräftades genom groning angiogenes analys. Medelhavsländerna visade sin förmåga att invadera (över 50 pm) murint ECM protein gel från 3D spheroids efter 24 timmar VEGF-stimulus (figur 2 C). Efter en vecka invaderande celler detekterades vid 300-600 um avstånd. Omvänt var invasion kapacitet förlorad i P2-MSC efter mesengenic differentiering (Figur 2 D). Figur 1. nyisolerade MPC har särdrag. Odling HBM-multinationella företag i DMEM / 10% PhAbs sju dagar ger upphov till en population av vilande Medelhavsländerna (A) lätt urskiljbara från MSC (B) </strong> i fråga om morfologi (A.1, B.1, skal barer = 100 pm), fenotyp (A.2, B.2), F-aktin distributions (rött i A.3, B.3), och nestin uttryck (grön i A.3, B.3, skal barer = 20 pm). klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Medelhavsländerna differentiera till standard MSC och Visa Spira Angiogenes in vitro. Byte av DMEM / PhAbs med kommersiellt tillgängliga RS medel utformade för MSC expansionen utlöser mesengenic induktion av Medelhavsländerna. Efter en vecka i kultur några rest partnerländerna är fortfarande detekterbara (P1-MSC) medan ytterligare passage i MSC-RS-medium leder till en population av konfluenta MSC-liknande celler (P2-MSC, en skala barer = 100 nm). P2-MSC terminalt differentierar till osteocyter eller adipocyter under lämplig stimuli som avslöjades av kalciumavsättning (grön i B) och lipiddroppe ackumulering (rött i B, skal barer = 200 nm), respektive. Medelhavsländerna visar konsekvent groning från sfäroider i murin ECM protein gel (C) vid en skillnad med P2-MSC (D, skal barer = 1,0 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders^14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity¹⁶, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation.

Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability^17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity^10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in “crude” and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)². Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.

A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation²¹. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs^5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum⁶. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.

MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported⁹ would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions.

It is not clear if these “contaminating” MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow²² or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.

Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation⁷. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described^5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as “Mesangiogenic Progenitor Cells”, maintaining the acronym MPCs.

We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages²³.

Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

Materials

Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9-12 mg/ml) Final Concentration: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μm Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Sweden)	17-5442-03	medium for discontinuos density gradient centrifugation
Pooled human AB type serum (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Final Concentration: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100X Final Concentration: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5%
Sodium Azide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Final Concentration: 0.02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/mL penicillin, 5,000 ug/mL Streptomycin Final Concentration: 50 UI/mL penicillin, 50 ug/mL Streptomycin
T-75 culture flask for suspension cultures	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658 190
T-75 culture flask TC treated	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Animal- free proteases detaching solution Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25%
anti-CD90 APC antibody  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-402	Final Concentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-609	Final Concentration: 1:40
anti-CD73 PE antibody (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-182	Final Concentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-105-260	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 APC antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-846	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-637	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-845	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-563	Final Concentration: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1'000 mg/l glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stock Concentration:0.2 mg/mL Final Concentration: 2 μg/mL
Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1X
Paraformaldehyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixative Final Concentration: 4%
LAB-TEK two-well chamber slides	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anti-Nestin antibody [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italy)	EMR237500	Final Concentration: '0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml
Pasteur Pipette	Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-678
Osteoimage Bone mineralization Assay	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution
50mL Polystyrene conical tube	Greiner bio-one (Kremsmünster Austria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm
Glycerin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Final Concentration: '50%
Polistirene Petri dishes	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
24-well plates TC-treated	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)	662160
Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)	LONZA (Walkersville MD-USA)	CC-3162	VEGF-rich endothelial cell growth medium
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Germany)		Image analysis software