이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 융모 세포영양세포세포(villous cytotrophoblast cells)가 연속적인 효소 분해에 의해 만삭 태반에서 분리된 후 밀도 원심분리, 배지 구배 분리 및 면역자기 정제를 수행하는 방법을 설명합니다. in vivo에서 관찰된 바와 같이, 1차 배양에서 단핵 융모 세포영양아세포 세포는 72시간 후에 다핵 세포영양아세포 세포로 분화합니다. 정상산소(8% O2)와 비교했을 때, 저산소증/재산소화(0.5% / 8% O2)를 겪는 융모 세포영양세포세포는 산화 스트레스와 내인성 세포사멸(ininsic apoptosis)이 증가하는데, 이는 생체내에서 관찰되는 임신 중 임신 합병증(preeclampsia, 조산, 자궁 내 성장 제한)과 같은 합병증과 유사합니다. 이러한 맥락에서, 저산소증/재산소 조건에서 배양된 1차 융모막아세포는 인간 태반에서 변형되는 메커니즘과 신호 전달 경로를 더 잘 이해하고 특정 임신 장애를 예방하는 효과적인 약물을 찾는 것을 용이하게 하는 독특한 실험 시스템을 나타냅니다. 인간 융모영양아세포(villous trophoblast)는 멜라토닌을 생성하고 합성 효소와 수용체를 발현합니다. 멜라토닌은 자간전증과 자궁 내 성장 제한에 대한 치료법으로 제안되었는데, 이는 멜라토닌의 보호 항산화 효과 때문입니다. 이 논문에 기술된 1차 융모 세포영양아세포 모델에서 멜라토닌은 정상 산소 상태의 영양막세포에 영향을 미치지 않지만 저산소증/재산소화에 의해 파괴된 세포융합세포의 산화환원 균형을 회복시킵니다. 따라서 1차 배양에서 인간 융모 영양막 세포는 저산소증/재산소화 중 태반 기능에 대한 멜라토닌의 보호 효과 뒤에 있는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 접근 방식입니다.
서론
인간 임신 중, 단핵 줄기 세포 인 cytotrophoblast 태반 세포는 빠르게 증식 또는 융모 extravillous cytotrophoblast 세포로 분화하거나. Extravillous cytotrophoblasts는 침략과 자궁 벽의 나선형 동맥을 개조. 융모 cytotrophoblasts 반면에, 다핵는 syncytiotrophoblast합니다 (syncytium) (1)를 형성하기 위해 증식 분화 퓨즈 계속한다. 융모 영양막 세포의 항상성의 유지 보수는 태아 웰빙과 건강한 임신을 위해 필수적이다. 사실, 융모 trophoblasts는 산소와 영양소의 모체 - 태아의 교환을 허용하고, 임신을위한 필수적인 호르몬을 생산하고 있습니다. 또한,는 syncytiotrophoblast는 모체 혈액 순환과 직접 접촉만을 셀형이며 필수적인 물리적 면역 장벽을 제공한다. 따라서,는 syncytiotrophoblast는 항상성 유지를위한 세포 사멸 및 교체를 받아야하고 AVO하기아이디 태반은 2-5 병리.
인간의 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts를 분리하기 위해 1986 년 Kliman 등. (6)에 의해 개발 된이 기술은 융모 영양막 세포의 분화에 관여....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
태반은 정보를 환자의 동의와 윤리위원회 (CHUM - 세인트 루크 병원 INRS - 인스 티 투트 아르망 - Frappier의 승인을 즉시 미끼 - 세인트 루크 병원, 몬트리올, QC, 캐나다에서 복잡하지 않은 임신에서 자연 질식 분만 후 얻었다 라발, QC, 캐나다).
산모 Cytotrophoblast 세포의 1. 분리 및 정제
- 솔루션 및 미디어
- 보완하여 전송 매체를 준비 둘 베코의 이글의 중간 높은 포도당 1 % 부피 /의 부피 항생제와 (DMEM-HG) (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장 4 ℃에서 수정.
- 10 % 부피 / 부피 소 태아 혈청 (FBS), 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1 % 부피 / 부피 항생제 (10,000 단위 / 가진 DMEM-HG를 보충하여 일차 배양 배지를 준비 ml의 페니실린 G 4 ° C에서 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장. 37 ° C에 따뜻한 미디어 전용도.
- 생리 식염수 (0.9 % 중량 / 부피의 염화나트륨)의 4 L를 준비한다.
- HBSS (PH 7.4) 1x에서....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
질식 분만에 의해 얻어진 일반 용어 태반에서 분리 및 융모 cytotrophoblast 세포의 immunopurification 1 × 10 8 가능한 세포를 얻었다. 태반은 350g 무게 원반 모양과 투명 막에 4cm 높이 직경 19cm였다. 더 자엽 기형은 발견되지 않았다. 탯줄은 paracentral 현지화 및 56cm의 길이를 가지고 있었다. 순도는 멘틴 및 사이토 케라틴-7 마커를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. 세포의 98 % 이상은 immunopurification 얻은 융모 trophoblasts 세포의 순도를 확인하는 사이토 케라틴-7 멘틴 대한 음성 및 양성이었다. 융모 cytotrophoblast 세포는 1mM의 멜라토닌의 존재 또는 부재하에 정상 산소의 조건 하에서 96 웰 배양 플레이트에 첨가 하였다. 융모 cytotrophoblasts의 생화학 적 분화는 β-인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 수준을 결정하여 모.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
포유 동물에서 태아의 발달은 적절한 태반 기능에 직접적으로 의존한다. 건강 장애의 발달 기원은 이후의 삶에서 나타난 질환의 원인은 초기 개발 및 태반 태아 프로그래밍 30-32에서 기계적 역할을하고 있음을 다시 추적 될 수 있다는 가설에 기초한다. 그것은 영양 전달을 조절 유해한 노출 방지 및 주요 내분비 기능을 가지고 : 태반은 태아의 성장과 발전의 중요한 매개체이다. Kliman 등으로 개발. 실행 가능한 기본 cytotrophoblasts을 분리하는 재현 기술의 정상 및 비정상 태반 기능 (6)의 연구의 이정표입니다. 많은 연구자 태반 18,20,33,34 생리를 이해 시험 관내에서 특정 조건을 재현하기 위해이 기술을 채택했다. Petroff 등의 알에 의해 설명 된 바와 같이. 많은 단계가 격리 된 사이토의 정제하고 강력한 수율을 보장하는 것이 중요합니다영양막 세포 18. 예를 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) (no. 262011-2009)에서 CV 및 CV 및 JTS에 대한 March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research 보조금(#12-FY12-179)의 보조금으로 지원됨; Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) 및 Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS에서 LSF로 학생 지원, Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE의 HC, 캐나다 보건 연구소 (CIHR) 및 FRQ-Santé의 AAHT, NSERC의 JBP로; Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) 및 Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT의 EMAS 펠로우십을 통해.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 곡선 형 Metzenbaum 가위 | Shandon | 9212 | 수술 장비 (세포 분리) (2 개) |
| 스플린터 집게 미세 41/2 인치 | Fisherbrand | 13-812-42 | 수술 장비 (세포 분리) (2 개) |
| 가위 4.5 Str 해부 | Fisherbrand | 08-940 | 수술 장비 (세포 분리) (2 개) |
| 거즈 스폰지 10cm x 10cm | Cardinal Health | ||
| 361020733 직사각형 유리 베이킹 디쉬 | Pyrex | 1105397 | 유리제품 (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | 유리제품 (지름 114mm) |
| 시계 유리 | pyrex | 9985100EMD | 유리 제품 |
| 포르말린 용액, 중성 완충, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | 조직학적 조직 고칠 용액 |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| 일회용 배양 튜브 | Kimble | 73750-13100 | 유리 제품 |
| 붕규산 유리 파스퇴르 피펫(22.8cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | 유리제품 |
| 250 ml 유리 비커 | Fisherbrand | KFS14005250 | 유리제품 |
| 유리 미디어 병 캡 포함 | Fisherbrand | KFS14395250 | 유리제품 (8개) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브 | Corning | 430791 | |
| 50 ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브 | Corning | 430829 | |
| 10 ml 혈청학적 피펫 | Corning | 11415038 | |
| 세포 여과기 100 μ m 나일론 | 코닝 | 431752 | |
| 흡수 라이너 | 사이언스웨어 | 1199918 | |
| 500 ml 병 상단 필터 | 코닝 | 모공: 0.22 &마이크로; m / medium 및 HBSS 준비 | |
| 2 ml Criogenic 바이알 | Corning | 430488 | |
| 냉동 용기, Nalgene Mr. | Frosty Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| 연동 펌프 | Pharmacia Fine Chemicals | P3 모델 | |
| 흔들리는 수조 | 피셔 | 모델 127 | |
| 진공 펌프 | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| 염화나트륨 | Fisherbrand | EC231-598-3 | 식염수 0.9% |
| 행크' s 완충염 용액 (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | 수량 : 소화 용액 1 L에 대해 9.25 (1 바이알) |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25ml(1M) 분해액 1L용 |
| 트립신 I형 | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U | |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
| 황산 마그네슘 | 베이커 | 2500-01 | 800mM |
| 둘베코' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 황산염 | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | 밀도 원심 분리 매체 구배. 용량: 36 ml |
| 이소프로판올 | 아크로스 | 42383-0010 | 50 ml |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치 | 472301 | |
| 오토맥스 자기 분리기 | Miltenyi Biotec | 모델 003 | |
| 오토맥 칼럼 | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| 자동 실행 버퍼 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 자동 헹굼 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc 정제 클론 W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | 안티-마우스 항체 |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| 다중 웰 플레이트 - 6 웰 포함 뚜껑 | Corning | 3335 | 셀 바인딩 표면 |
| 다중 웰 플레이트 - 뚜껑이 있는 24 | Corning | 3337 | 셀 바인딩 표면 |
| 다중 웰 플레이트 - 뚜껑이 있는 96 | Corning | 3300 | 셀 바인딩 표면 |
| 모듈식 인큐베이터 챔버 | Billups-Rothenberg | MIC-101 | 두 개 세트는 정상 산소 및 저산소증/재산소 조건을 동시에 생성하는 데 필요합니다 |
| . 단일 유량계 | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50mm 인라인 필터 | Whatman | 6721-5010 | PTFE, 기공: 1.0 &마이크로; m |
| 가스 레귤레이터 | Pro Star | PRS301233 | 노르목시아와 저산소/재산소 조건을 동시에 생성하기 위해 두 세트가 필요합니다 |
| . 가스 호스 Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3개 ~ 0.5 m |
| 17 mm 조절 가능한 가스 호스 클램프 | 타이랩 | THCSS-16 | |
| Normoxia 가스 실린더 | Praxair | NI CDOXR1U-K | 사이즈 K (3rd 삼분기 구성: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia 가스 실린더 | Praxair | NI CDOXR1U-K | 크기 K (3rd 삼분기 구성: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| 산소 미세전극 Mi-730 | 미세전극 INC | 84477 | |
| 산소 어댑터 | 미세전극 INC | 3572 | |
| ROS 검출 시약: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA 키트 | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin 정제 항체 | eBioscience | 14-9897 | 호스트: 마우스 |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) 항체 | Abcam | ab119697 | 호스트: 마우스 |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 무스 IgG H& L 항체 | Life Technologies | A-11029 |
참고문헌
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Fac....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
