Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Summary

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 ⁺ CD34 ^– pericitos e células CD34 ⁺ CD146 ^– células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^– pericytes and vascular CD34⁺CD146^– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

O coração tem sido considerada um órgão de pós-mitótico. No entanto, estudos recentes têm demonstrado a presença de volume de negócios de cardiomiócitos limitada nos corações humanos adultos ^1. As células-tronco / progenitoras nativas com potencial de diferenciação de cardiomiócitos também foram identificados dentro do miocárdio em roedores adultos e corações humanos, incluindo Sca-1 ^+, c-kit ^+, formando-cardiosphere e, mais recentemente, as células precursoras perivasculares ^2,3. Estas células representam candidatos atraentes para terapias destinadas a reforçar cardíaca reparação / regeneração por meio de transplante de células ou a estimulação da proliferação in-situ.

Mesenquimais estaminais / células do estroma (MSC) foram isoladas a partir de quase todos os tecidos humanos ^4,5 ensaios clínicos das aplicações terapêuticas de MSC foram realizadas para várias condições patológicas, tais como a reparação cardiovascular ^6, reacção do enxerto contra o hospedeiro de doença ⁷ </sup>, E cirrose hepática ^8. Efeitos benéficos têm sido atribuídas à capacidade de MSCs para: lar de locais de inflamação ^9; diferenciarem em diferentes tipos de células ^10; secretam moléculas pró-reparadoras ^11; e modular a resposta imune do hospedeiro ^12. O isolamento de MSCs tem tradicionalmente contado com a sua adesão preferencial aos substratos de plástico. No entanto, a população resultante de células é tipicamente sensivelmente ¹³ heterogénea. Através da utilização de células activadas fluorescentes (FACS) com uma combinação de marcadores chave de células perivasculares, fomos capazes de isolar e purificar uma população precursora MSC como multipotentes (CD146 ⁺ / CD31 ^– / CD34 ^– / CD45 ^– / CD56 ^-) a partir de vários tecidos humanos, incluindo adultos músculo esquelético e gordura branca ^14.

populações de células em vários tecidos perivasculares não cardíacos foram mostrados como tendo propriedades / progenitoras de células-tronco umnd estão sendo investigados para uso clínico no cenário cardiovascular. Pericitos, um dos subconjuntos de células perivasculares mais conhecidos, são uma população heterogênea que desempenhar vários papéis fisiopatológicos, incluindo no desenvolvimento de novos vasos ^15, a regulação da pressão arterial ^16, e manutenção da integridade vascular ^17,18. Como mostrado em vários tecidos, subconjuntos específicos de pericitos nativamente expressar antigénios MSC e sustentar seus fenótipos MSC-like em cultura primária após FACS purificação ^14. Além disso, estas células de manter de forma estável os seus fenótipos de longo prazo no interior da cultura e exibem potencial de diferenciação de multi-linhagem, semelhante ao MSC ^19,20. Estes resultados sugerem que pericitos são uma das origens da MSC evasivo ^14. O potencial terapêutico dos pericitos foi demonstrada com uma redução na formação de cicatrizes do miocárdio e função cardíaca melhorada após o transplante em feridas isquemicamentecorações ^21. Recentemente, purificado com sucesso pericitos do miocárdio humano e demonstrou seus fenótipos MSC-like e multipotency (adipogênese, condrogênese e osteogênese) com a ausência de tecido muscular esquelético ^3. Além disso, pericitos do miocárdio apresentaram diferenciais cardiomiogênico capacidades potenciais e angiogénicos quando comparado com os seus homólogos purificados a partir de outros órgãos.

A segunda população de células estaminais / progenitoras multipotentes perivasculares, a célula adventícia, foi isolado a partir de veias safenas humanas com base na expressão positiva CD34 ^22. Células adventícias venoso foram mostrados como tendo um potencial clonogénico, capacidade de diferenciação mesodérmicos e potencial pró-angiogénico in vitro. Transplante destas células para os corações de ratos lesionados por isquemia resultou numa redução na fibrose intersticial, um aumento na angiogénese e o fluxo sanguíneo do miocárdio, reduzida dil ventricularção, e aumento da ejecção cardíaca fracção ^23. Interessantemente, as células adiposas adventícia foram mostrados a perder expressão de CD34 e CD146 regular a expressão na cultura em resposta ao tratamento angiopoietina II, sugerindo que a adopção de um fenótipo de pericitos estimulação com ^24. Dentro do coração, no entanto, a população de células da adventícia ainda não foi prospectivamente purificado por FACS e / ou bem caracterizados. Utilizando os procedimentos de isolamento celular descritos nas seções a seguir, estamos actualmente a caracterizar células adventícias do miocárdio e investigar o seu potencial para aplicações regenerativas.

Aqui nós descrevemos um método para isolar e purificar duas subpopulações de células estaminais / progenitoras perivasculares do miocárdio fetal ou adulto humano. Este método de isolamento de células prospectivo vai permitir aos investigadores obter subconjuntos de células tronco / progenitoras perivasculares isogênicas de biópsias cardíacas humanas para estudos comparativos e furtheR explorar o seu potencial terapêutico em várias condições patológicas cardíacas.

Protocol

1. Processamento de Cardiac Humano Amostra Certifique-se que todos os fluidos, recipientes, instrumentos e da área operacional dedicado são estéreis. Colocar a amostra de tecido cardíaco (adquiridos pelo banco de tecidos ou equipa cirúrgica) em meio de armazenamento composto de forma refrigerada de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo para o transporte 3. Retirar a amostra cardíaca …

Representative Results

As células individuais foram distinguidos dos detritos e dupletos na base de distribuições dispersão frontal e lateral. células vivas foram identificados por sua incapacidade de absorver o corante DAPI. A estratégia gating foi escolhido com base na rotulagem deste vivo, dissociação de células inteiras cardíaca (Figura 1) controlo de isotipo. A partir das células vivas, células CD45 + foram fechado em primeiro lugar para fora, seguido de células CD…

Discussion

A evidência crescente suporta uma capacidade regenerativa limitada do coração humano adulto após a lesão. Identificação e caracterização de células precursoras nativas responsáveis ​​por estas respostas regenerativos em corações feridos são crítica, tanto para a compreensão dos mecanismos associados e vias de sinalização e o desenvolvimento de abordagens para utilizar estas células terapeuticamente.

Protocolos anteriores descreveram o isolamento de subconjuntos de cél…

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter