Summary

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Published: October 08, 2016
doi:

Summary

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 pericyten en CD34 + CD146 adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34 pericytes and vascular CD34+CD146 adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

Het hart is lang beschouwd als een post-mitotische orgaan. Echter, recente studies de aanwezigheid van cardiomyocyt omzet beperkt bij volwassen menselijk hart 1 aangetoond. Inheemse stam / voorlopercellen met cardiomyocyt differentiatie potentieel zijn ook geïdentificeerd binnen het myocard bij volwassen knaagdieren en menselijke harten, met inbegrip van Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere-vorming, en het meest recent, perivasculaire voorlopercellen 2,3. Deze cellen zijn aantrekkelijke kandidaten voor therapieën die gericht zijn op verbetering van cardiale herstel / regeneratie via cel transplantatie of stimulatie van in-situ proliferatie.

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) zijn geïsoleerd uit bijna alle menselijke weefsels 4,5 Klinische proeven van de therapeutische toepassingen van MSC zijn uitgevoerd voor meerdere pathologische omstandigheden uitgevoerd zoals hart- reparatie 6, graft-versus-host ziekte 7 </sup> En levercirrose 8. Gunstige effecten zijn toegeschreven aan het vermogen van MSCs tot: huis aan ontstekingsplaatsen 9; differentiëren in verschillende celtypes 10; scheiden pro-herstellende moleculen 11; en moduleren gastheer immuunreacties 12. De isolatie van MSC's is van oudsher vertrouwd op hun preferentiële hechting aan plastic substraten. De resulterende celpopulatie is typisch aanmerkelijk heterogeen 13. Van door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met een combinatie van essentiële perivasculaire celmerkers, konden wij isoleren en zuiveren van een multipotente MSC-achtige precursor populatie (- / CD34 / CD45 / CD56 CD146 + / CD31) geweest meerdere menselijke weefsels waaronder volwassen skeletspier en wit vet 14.

Er is aangetoond perivasculaire cel bevolking in diverse niet-cardiale weefsels stam / voorlopercellen cel eigenschappen van een hebbennd worden onderzocht voor klinisch gebruik bij de cardiovasculaire instelling. Pericyten, een van de meest bekende perivasculaire cel subsets, een heterogene populatie die verschillende pathofysiologische functies, waaronder de ontwikkeling van nieuwe vaten 15 te spelen, de regulatie van de bloeddruk 16 en onderhouden van vasculaire integriteit 17,18. Zoals getoond in verschillende weefsels, specifieke subgroepen van pericytes native uiten MSC antigenen en hun MSC-achtige fenotypes in primaire cultuur in stand te houden na FACS zuivering 14. Bovendien zijn deze cellen die stabiel behouden hun lange termijn fenotypes binnen de cultuur en vertonen multi-lijn differentiatie potentieel, vergelijkbaar met MSC's 19,20. Deze resultaten suggereren dat pericytes zijn een van de oorsprong van de ongrijpbare MSC 14. Het therapeutisch potentieel van pericyten aangetoond met een vermindering van myocardiale littekenvorming en verbeterde hartfunctie na transplantatie in ischemisch gewondenharten 21. Onlangs hebben we met succes gezuiverd pericyten van de menselijke hartspier en koos MSC-achtige fenotypen en multipotent (adipogenese, chondrogenese en osteogenese) het ontbreken van skelet myogenesis 3. Bovendien vertoonden myocardiale pericyten cardiomyogene differentiële potentie en angiogene capaciteit vergeleken met tegenhangers gezuiverd van andere organen.

Een tweede populatie van multipotente perivasculaire stam / progenitorcellen, de adventitia cel, is geïsoleerd uit menselijke aderen op basis van positieve CD34 expressie 22. Veneuze adventitia-cellen is aangetoond dat potentiële klonale, mesodermale differentiatievermogen en pro-angiogene potentieel in vitro hebben. Transplantatie van deze cellen in het ischaemisch gewonden harten van muizen resulteerde in een afname van interstitiële fibrose, een toename van angiogenese en myocardiale bloedstroom, verminderde ventriculaire dilatie, en verhoogde cardiale ejectiefractie 23. Interessant is dat vetweefsel adventitia cellen is aangetoond dat CD34 expressie te verliezen en upregulate CD146 expressie in cultuur in reactie op angiopoietine II behandeling, wat suggereert dat de goedkeuring van een pericyte fenotype met stimulering 24. In het hart, maar de adventitia celpopulatie nog niet prospectief gezuiverd door FACS en / of goed gekarakteriseerd. Gebruik makend van de cel isolatie procedures in de volgende gedeelten worden beschreven, zijn we momenteel karakteriseren myocard adventitia cellen en het onderzoeken van hun potentieel voor regeneratieve toepassingen.

Hierin beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en zuiveren twee subpopulaties van perivasculaire stam / progenitorcellen uit humaan foetaal of volwassen myocardium. Deze prospectieve cel isolatie methode zal onderzoekers in staat stellen om isogene perivasculaire stamcellen / voorlopercellen cel subsets van menselijk hart biopsieën voor vergelijkende studies en furthe verkrijgenr verkennen hun therapeutisch potentieel in diverse cardiale pathologische omstandigheden.

Protocol

1. De verwerking van de Mens Cardiac Sample Zorg ervoor dat alle vloeistoffen, containers, instrumenten, en de specifieke operationele gebied zijn steriel. Plaats het hartweefsel monster (verkregen door de weefselbank of chirurgische team) in opslagmedium samengesteld gekoeld Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S) op ijs 3 transport. Verwijder de cardiale monster uit het opslagmedium en was met e…

Representative Results

Enkele cellen werden onderscheiden van puin en doubletten op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing distributies. Levende cellen werden geïdentificeerd door hun falen te maken van de DAPI kleurstof. De gating strategie werd gekozen op basis van isotype controle etikettering van deze levende, hele hartcel dissociatie (figuur 1). Vanuit de levende cellen, werden CD45 + cellen eerst gated out, gevolgd door CD56 + cellen. CD144 + e…

Discussion

Steeds meer bewijs ondersteunt een beperkte regeneratieve capaciteit van de volwassen menselijk hart na een blessure. Identificatie en karakterisatie van natief precursorcellen verantwoordelijk zijn voor dergelijke regeneratieve respons gewonde harten essentieel voor zowel het begrijpen van geassocieerde mechanismen en signaalwegen en de ontwikkeling van benaderingen van deze cellen therapeutisch gebruik.

Vorige protocollen zijn de isolatie van perivasculaire voorloper cel subsets beschreven…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

Play Video

Cite This Article
Baily, J. E., Chen, W. C., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

View Video