Isolering av perivaskulær multipotente forløpercelle populasjoner fra humane kardiale Tissue

Summary

Menneskelig hjertevev havner multipotente perivaskulær forløper cellepopulasjoner som kan være egnet for hjerteinfarkt regenerering. Teknikken som er beskrevet her gjør det mulig for samtidig isolering og rensing av to multipotente stromale cellepopulasjoner forbundet med native blodkar, dvs. CD146 ⁺ CD34 ^– pericytes og CD34 ⁺ CD146 ^– adventitia-celler fra den humane myokardium.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^– pericytes and vascular CD34⁺CD146^– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

Hjertet har lenge vært betraktet som en post-mitotisk organ. Imidlertid har nyere studier vist tilstedeværelse av begrenset kardiomyocytt omsetningen hos voksne menneskers hjerter ^1. Native stilk / stamceller med kardiomyocytt differensiering potensial har også blitt identifisert innen hjertemuskelen i voksen gnager og menneskelige hjerter, inkludert Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere dannende, og sist, perivaskulær forloperceller ^2,3. Disse cellene representerer attraktive kandidater for behandling med sikte på å styrke hjerte reparasjon / regenerering gjennom celletransplantasjon eller stimulering av in-situ spredning.

Mesenchymale stilk / stromaceller (MSC) har blitt isolert fra nesten alle humant vev ^4,5 Kliniske studier av de terapeutiske anvendelser av MSC har blitt utført for flere patologiske tilstander slik som kardiovaskulær reparasjon ^6, graft-versus-host-sykdom ⁷ </sup>, Og levercirrhose ^8. Gunstige effekter har blitt tilskrevet evnen til MSC til: hjem til områder av betennelse ^9; differensiere til forskjellige celletyper ^10; utsondre pro-reparerende molekyler ^11; og modulere vert immunresponser ^12. Isolasjon av MSC har tradisjonelt støttet seg på sin fortrinnsrett tilslutning til plast underlag. Men den resulterende populasjon av celler er typisk markert heterogen ^13. Ved å bruke fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) med en kombinasjon av sentrale perivaskulær celle markører, har vi vært i stand til å isolere og rense et multipotent MSC-lignende forløper befolkningen (CD146 ⁺ / CD31 ^– / CD34 ^– / CD45 ^– / CD56 ^-) fra flere menneskelig vev, inkludert voksen skjelettmuskulatur og hvitt fett ^{til 14.}

Perivaskulær celle populasjoner i ulike ikke-kardiale vev har vist seg å ha stilk / stamcelleegenskaper ennd blir undersøkt for klinisk bruk i hjerte-innstillingen. Pericytes, en av de mest kjente perivaskulær celle undergrupper, er en heterogen befolkning som spiller flere patofysiologiske roller inkludert i utviklingen av nye skip ^15, regulering av blodtrykk ^16, og vedlikehold av vaskulær integritet ^17,18. Som vist i flere vev, bestemte undergrupper av pericytes opprinnelig uttrykke MSC antigener og opprettholde sine MSC-lignende fenotyper i primærkultur etter FACS rensing ^14. Videre disse cellene stabilt opprettholde sine langsiktige fenotyper innen kultur og vise multi-avstamning differensiering potensial, i likhet med MSC ^19,20. Disse resultatene tyder på at pericytes er en av opprinnelsen til den unnvikende MSC ^14. Det terapeutiske potensialet for pericytes er vist med en reduksjon i myokardialt arrdannelse og forbedret hjertefunksjon etter transplantasjon inn i ischemisk skadehjerter ^21. Nylig har vi lykkes renset pericytes fra menneskehjertemuskelen og demonstrerte sin MSC-lignende fenotyper og multipotency (adipogenesen, chondrogenesis og Osteogensesis) med fravær av skjelett myogenesen ^tre. I tillegg hjerteinfarkt pericytes utstilt differensial cardiomyogenic potensielle og angiogene kapasitet sammenlignet med kolleger renset fra andre organer.

En andre populasjon av multipotente perivaskulære stilk / stamceller, den adventitia-cellen, har blitt isolert fra humane saphenous vener på grunnlag av positiv CD34 ekspresjon ^22. Venøs adventitia-celler har vist seg å ha klonogene potensial, mesodermal differensiering kapasitet og proangiogenic potensial in vitro. Transplantasjon av disse cellene inn i ischemisk skadede hjerter mus resulterte i en reduksjon i interstitiell fibrose, en økning i angiogenese og myokardial blodstrøm, redusert ventrikulær dilasjon, og økt hjerte ejeksjonsfraksjon ^23. Interessant, har adipose adventitia celler er vist å miste CD34 uttrykk og oppregulere CD146 uttrykk i kulturen som svar på Angiopoietin II behandling, noe som tyder på at innføringen av en pericyte fenotype med stimulering ^24. I hjertet, men de adventitia cellepopulasjon har enda ikke blitt prospektivt renset ved FACS og / eller godt karakterisert. Utnytte celleisolasjonsprosedyrer som er beskrevet i de neste avsnittene, er vi for tiden karakter hjerteinfarkt adventitia celler og undersøke deres potensial for fornybare applikasjoner.

Heri vi beskriver en metode for å isolere og rense to subpopulasjoner av perivaskulære stammen / stamceller fra human fetal eller voksen myokard. Denne prospektive celle isolasjonsmetoden gjør at forskerne å få isogene perivaskulær stilk / stamcelle undergrupper fra menneskelige hjerte biopsier for komparative studier og further utforske deres terapeutiske potensiale i forskjellige hjerte patologiske tilstander.

Protocol

1. Processing of Human Cardiac Sample Påse at alle væsker, containere, instrumenter, og den dedikerte operasjonsområdet er sterile. Plasser hjertevevet prøven (innhentes av vev bank eller kirurgisk lag) i lagringsmediet består av kjølt Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (P / S) på is for transport 3. Fjern det kardiale prøven fra lagringsmediet og vaskes med et vaskemedium bestående av fosf…

Representative Results

Enkeltceller ble skilles fra rusk og dubletter på grunnlag av forover og side scatter distribusjoner. Levende celler, ble identifisert ved deres manglende evne til å ta opp fargestoff DAPI. Den gating strategien ble valgt på grunnlag av isotypekontrollantistoff merking av dette live, hel-hjerte celledissosiasjon (figur 1). Fra levende celler, ble CD45 + -celler første silt ut, etterfulgt av CD56 + celler. CD144 + endotelceller ble der…

Discussion

Økende bevis støtter en begrenset evne til reproduksjon av den voksne menneskehjertet etter skade. Identifisering og karakterisering av innfødte forloperceller ansvarlige for slike regenerativ respons i skadde hjerter er avgjørende for både forståelsen av tilhørende mekanismer og signalveier og utvikling av metoder for å utnytte disse cellene terapeutisk.

Tidligere protokoller er beskrevet isoleringen av perivaskulære forløper celleundergrupper fra human skjelettmuskel ^25.</su…

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter