Summary

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

Trofoblast kök hücreleri (TSCs) memeli gelişiminin ilk hücre kaderi karar bir sonucu olarak ortaya çıkar. Onlar kendini yenilemek ve plasentanın fetal kısmına hücre popülasyonu veren yükselişi kök vivo eşdeğer trofoblast soy tüm alt içine ayırt etmek yeteneğini koruyarak, in vitro kültüre edilebilir. Bu nedenle, TSCs in vitro ekstra embriyonik hücre kaderi kararı karşısında plasental gelişim ve embriyonik incelemek için eşsiz bir model sunuyoruz. itibaren blastosist aşamasına gelen DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları oluşan ayrı bir epigenetik bariyer sıkıca her iki soy ayırır. Burada, tam aşırı ifadesi fare embriyonik fibroblastlar trofoblast anahtar düzenleyiciler Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ve geçici bu soy engeli aşmak için bir protokol açıklar. uyarılmış trofoblast kök hücreler kendini yenilemek mümkün ve türetilmiş trofoblast kök hücreleri blastokist hemen hemen aynıdır imorfoloji, işaretleyici gen ifadesi ve metilasyon motifinin n terimleri. In vitro ve in vivo deneylerde Fonksiyonel bu hücrelerin trofoblast soy polyploid trofoblast dev hücrelerin üretilmesi ve blastosist enjekte edildiğinde plasentayı kimerize boyunca ayırt etmek mümkün olduğunu onaylayın. somatik doku trofoblast kök hücrelerin uyarılması, bu ekstra-embriyonik soyunun genetik ve epigenetik özelliklerini incelemek için yeni yollar açar ve ilgili embriyo zarar vermeden trofoblast kök hücre hatları üretme imkanı sunuyor.

Introduction

Son zamanlarda, kök hücreler dönüşüm trofoblast fare embriyonik kök hücre çeşitli yaklaşımlar karşılaştıran bir çalışma, tüm analiz sistemleri, soy dönüşüm eksik kaldığını ortaya koymuştur. Bunun yerine bu yüzden trofoblast kök denilen uyarılmış trofoblast kök hücreler (iTSCs) hücre benzeri hücreler kökenli 1 hücre kaderi bir hafıza istinat oluşturulmuştur. Burada, ITSC nesil farklı bir yaklaşım izledi. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) 2 pluripotent kök hücrelerin doğrudan indüklenmesi benzer şekilde, iTSCs doğrudan farklılaşmış somatik dokudan dönüştürüldü. İlk olarak, biz MEFS aşırı eksprese zaman TSC kaderi uyaran 12 aday faktörleri belirledi. Daha sonra, faktör Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ITSC indüksiyonu 3 için gerekli ve yeterli olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı olarak, başka bir grubu, bağımsız olarak iTSCs halinde MEFS dönüştürmek için yeterli olması Tfap2c, Gata3 ve Eomes bulundu. Bununla birlikte, buÇalışma, transgen ekspresyonu için gereken zamanın büyük ölçüde daha uzun ETS2 transdiferansiasyon kokteyl 4'ten olmadığı zaman, farklı dönüşüm kinetik gösteren, çalışmamızda karşılaştırılır.

Uyarılmış ve blastosist türetilmiş trofoblast kök hücre kültürü içeren geleneksel fetal sığır serumu (FBS), büyüme inaktive MEF'ler 5,6 salgılanan faktörler varlığında dayanır. ITSC ​​İndüksiyon sırasında, bu faktörler transgenlerin tam kombinasyon yoktur ve transdiferansiyonun geçiren değildir MEF'ler, tarafından sağlanır. Ancak, bir kez bireysel ITSC kolonileri onlar büyüme inaktive MEFS tarafından öngörülmekte olan medya, gerek alt kültür. Orada kaynaktan, iTSCs kültürlenmiş ve standart protokollere göre blastosist türetilmiş TSCs gibi tedavi olabilir. Not, hücre kültürü yemekleri jelatinleştirmeden olmadan Tanaka et al. 5, rutin kültür TSCs ve iTSCs aksine.

Protocol

Tüm fare deneyleri, hayvan koruma ve yerel kurumsal hayvan bakım komiteleri (Landesamt fuer Natur, Çevre und Verbraucherschutz, Kuzey Ren-Vestfalya [onay kimlik numarası onayı ile anlaşarak Alman hukukuna göre yapılmıştır: 84-02.04.2013 AZ .A428]). 1. Medya Hazırlık Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), penisilin / streptomisin (1x): 293T orta hazırlayın. DMEM,% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM)…

Representative Results

4F transgen ifadesi aktive çanak, hücreler hızla morfolojisi (Şekil 2A ve B karşılaştırın) değiştirin. Gün etrafında 14-21 farklı transdiferensiye alanlar (iki örnek Şekil 2B ve C olarak verilmiştir) ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik TSC morfolojisi eksikliği; ancak onlar sıkı kenarları ve iyi niyetli bir TSCs son derece anımsatan parlak sınırları ile alt-kültür, karakteristik epitel morfoloji ortaya (Şekil 2…

Discussion

Burada sunulan 4 faktörü (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) esaslı transdiferansiasyon protokolü sadakatle oluşturmak fare embriyonik fibroblastlar gelen iTSCs dönüştürülmüş güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Dahası, yöntem olmasına rağmen embriyonik fibroblastlar 3 ile karşılaştırıldığında verimlilik bir damla ile, aynı zamanda doğum sonrası kuyruk fibroblastlar için geçerlidir. Genel olarak, birincil fibroblast kaliteli transdiferansiasyon sonuçları ve bakım kritik bir faktör er…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
  5. Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
  6. Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
  7. Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
  8. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  9. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  10. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

View Video