Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल (TSCs) स्तनधारी विकास में पहली सेल भाग्य निर्णय का एक परिणाम के रूप में उत्पन्न होती हैं। वे इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है, आत्म नवीकरण और trophoblast वंश के सभी उपप्रकार, विवो के बराबर में अंतर करने की नाल के भ्रूण हिस्से के लिए सेल की आबादी जन्म देने के स्टेम करने की क्षमता को बनाए रखना है। इसलिए, TSCs अपरा विकास और भ्रूण बनाम इन विट्रो में अतिरिक्त भ्रूण सेल भाग्य के फैसले का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल पेश करते हैं। ब्लास्टोसिस्ट चरण के बाद से, एक अलग epigenetic डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन संशोधनों से मिलकर बाधा कसकर दोनों प्रजातियों अलग करती है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल पूरी तरह से अधिक अभिव्यक्ति trophoblast प्रमुख नियामकों Tfap2c, Gata3, Eomes और Ets2 murine भ्रूण fibroblasts में की क्षणिक द्वारा इस वंश बाधा को दूर करने का वर्णन है। प्रेरित trophoblast स्टेम कोशिकाओं आत्म नवीनीकृत करने के लिए सक्षम हैं और लगभग निकाली गई trophoblast स्टेम कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट के लिए समान हैं मैंआकृति विज्ञान, मार्कर जीन अभिव्यक्ति और मेथिलिकरण पैटर्न की दृष्टि से n। इन विट्रो और इन विवो assays में कार्यात्मक पुष्टि करते हैं कि इन कोशिकाओं trophoblast वंश polyploid trophoblast विशाल कोशिकाओं को उत्पन्न करने और जब ब्लास्टोसिस्ट्स में इंजेक्शन नाल chimerizing साथ अंतर करने में सक्षम हैं। दैहिक ऊतकों से स्टेम सेल trophoblast की प्रेरण इस अतिरिक्त भ्रूण वंश के आनुवंशिक और epigenetic विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए नए रास्ते खोलता है और संभावना संबंधित भ्रूण नष्ट करने के बिना trophoblast स्टेम सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रदान करता है।
हाल ही में, माउस भ्रूणीय स्टेम सेल की कई दृष्टिकोण स्टेम कोशिकाओं रूपांतरण trophoblast की तुलना में एक अध्ययन से पता चला है कि सभी का विश्लेषण प्रणाली में, वंश रूपांतरण अधूरा रह गया। प्रेरित trophoblast स्टेम सेल (iTSCs) तो trophoblast स्टेम बुलाया के बजाय सेल कोशिकाओं की तरह मूल 1 की सेल भाग्य की एक स्मृति बनाए रखने उत्पन्न किया गया है। यहाँ, हम ITSC पीढ़ी के लिए एक अलग दृष्टिकोण का पालन किया। Murine भ्रूण fibroblasts (MEFs) 2 से स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण के लिए इसी प्रकार, iTSCs सीधे विभेदित दैहिक ऊतक से बदल दिया गया है। सबसे पहले, हम 12 उम्मीदवार टीएससी भाग्य उत्प्रेरण जब MEFs में overexpressed कारकों की पहचान की। बाद में, कारकों Tfap2c, Gata3, Eomes और Ets2 ITSC प्रेरण 3 के लिए आवश्यक और पर्याप्त होना करने के लिए पहचान की गई है। इसके साथ ही, एक और समूह को स्वतंत्र रूप से Tfap2c, Gata3 और Eomes पाया iTSCs में MEFs परिवर्तित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। हालांकि, किअध्ययन, समय transgene अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक काफी लंबे समय तक हमारे अध्ययन की तुलना में है, अलग अलग रूपांतरण कैनेटीक्स का संकेत है, जब Ets2 transdifferentiation कॉकटेल 4 से अनुपस्थित है।
परम्परागत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) प्रेरित और ब्लास्टोसिस्ट निकाली गई trophoblast स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति युक्त विकास निष्क्रिय MEFs 5,6 द्वारा स्रावित कारकों की उपस्थिति पर निर्भर करता है। ITSC प्रेरण के दौरान, इन कारकों MEFs, जो ट्रांसजीन से भरा संयोजन की कमी है और transdifferentiation के दौर से गुजर नहीं कर रहे हैं द्वारा प्रदान की जाती हैं। हालांकि, एक बार व्यक्ति ITSC कालोनियों उप-सुसंस्कृत हैं, वे मीडिया है, जो विकास निष्क्रिय MEFs से preconditioned कर दिया गया है की आवश्यकता होती है। वहाँ से, iTSCs सुसंस्कृत और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ब्लास्टोसिस्ट निकाली गई TSCs की तरह व्यवहार किया जा सकता है। ध्यान से, सेल संस्कृति व्यंजन gelatinizing बिना अल। तनाका एट 5, हम नियमित संस्कृति TSCs और iTSCs के विपरीत।
4 कारक (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) आधारित transdifferentiation यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ईमानदारी से उत्पन्न करने के लिए माउस भ्रूण fibroblasts से iTSCs परिवर्तित एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, विधि भी हालांकि भ्रूण fibroblasts 3 क…
The authors have nothing to disclose.
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
129S2SV | Charles River | 129 |