Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
Трофобласта стволовые клетки (TSCS) возникают как следствие первого решения клеточных судеб в развитии млекопитающих. Их можно культивировать в лабораторных условиях , сохраняя при этом способность к самообновлению и дифференцироваться во все подтипы трофобласта линии, что эквивалентно в естественных условиях популяции клеток, приводящее к фетальной части плаценты стебля. Поэтому TSCS предлагают уникальную модель для изучения развития плаценты и эмбриональных против внеэмбриональной решения клеточных судеб в пробирке. От стадии бластоцисты года, особым местом эпигенетическое барьер, состоящий из метилирования ДНК и модификации гистонов плотно отделяет оба родословных. Здесь мы опишем протокол, чтобы полностью преодолеть этот барьер с помощью клонов переходного процесса избыточная экспрессия трофобласта ключевых регуляторов Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 в мышиных эмбриональных фибробластов. Индуцированные трофобласта стволовые клетки способны к самообновлению и почти идентичны БЛАСТОЦИСТНОЙ производных трофобласта стволовых клеток яп по морфологии, экспрессии генов и маркеров метилирования. Функциональная в пробирке и в естественных условиях анализов подтверждают , что эти клетки способны дифференцироваться трофобласт родословная генерации полиплоидных трофобласта гигантские клетки и chimerizing плаценту при введении в бластоцисты. Индукция трофобласт стволовых клеток из соматических тканей открывает новые возможности для изучения генетических и эпигенетических характеристик этой внеэмбриональной линии и предлагает возможность генерировать линии трофобласт стволовых клеток без разрушения соответствующего эмбриона.
Introduction
В последнее время, исследование, сравнивая несколько подходов эмбриональных стволовых клеток мыши, чтобы трофобласта превращение стволовых клеток показало, что во всех анализируемых систем, преобразование родословная оставалась незавершенной. Вместо индуцированных стволовых клеток трофобласта (iTSCs) так называемые трофобласта стволовые клетки , как клетки были сгенерированы сохраняя память о клеточной судьбы происхождения 1. Здесь мы следовали другой подход генерации ITSC. По аналогии с прямой индукции плюрипотентных стволовых клеток из мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) 2, iTSCs были непосредственно преобразованы из дифференцированной соматической ткани. Во-первых, мы определили 12 факторов, побуждающие кандидатов TSC судьбу, когда избыточно экспрессируется в MEFs. В дальнейшем, факторы Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 были идентифицированы , чтобы быть необходимым и достаточным для индукции ITSC 3. Одновременно другая группа независимо друг от друга нашли Tfap2c, Gata3 и Eomes быть достаточным для превращения MEFs в iTSCs. Тем не менее, в том, чтоИсследование, время , необходимое для трансгенной экспрессии значительно больше по сравнению с нашего исследования, что указывает на различные кинетики конверсии, когда ETS2 отсутствует в трансдифференцировку коктейль 4.
Обычные фетальной бычьей сыворотки (FBS) , содержащей культуру индуцированных и бластоцисты полученных трофобласта стволовых клеток зависит от наличия факторов , секретируемых роста инактивированной MEFs 5,6. Во время индукции ITSC эти факторы обеспечиваются MEFs, которые испытывают недостаток в полной мере сочетание трансгенов и не подвергающихся трансдифференцировку. Тем не менее, как только отдельные колонии ITSC являются субкультивироваться, они требуют средств массовой информации, которые были выдержано ростом инактивированной MEFs. С этого момента, iTSCs могут быть выращены и обработаны как бластоцисты получены TSC, в соответствии со стандартными протоколами. Следует отметить, что в отличие от Tanaka и др. , 5, мы обычно культуры TSC , и iTSCs без желатинирования клеточной культуры блюда.
Protocol
Representative Results
Discussion
4 фактора (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) на основе протокола трансдифференцировка, представленный здесь предлагает надежный метод для создания точно конвертирована iTSCs из эмбриональных фибробластов мыши. Кроме того, способ также применим для послеродовых хвостовых фибробласты, хотя и с падением эф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
