Summary

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta – Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo – Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.

Introduction

Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen – Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist.

Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.

Protocol

AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]). 1. Medienvorbereitung Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). Bere…

Representative Results

Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (…

Discussion

Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
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  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
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  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

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Cite This Article
Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

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