Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

Dendritiske celler (DCS) er væsentlige mediatorer af medfødte og adaptive immunforsvar. De fungerer til at fremkalde primære immunrespons og lette udviklingen af ​​immunologisk hukommelse. Disse celler er primært ansvarlige for antigen capture, migration og T-celle-stimulering og betegnes derfor som professionelle antigenpræsenterende celler (APC'er) 1 .Manipulation af DC'er kunne bruges på tværs af en bred vifte af forskningsområder og i det kliniske miljø at behandle forskellige inflammatoriske sygdomme, såsom HIV 6,7, cancer 8, autoimmune sygdomme 9 og allergiske reaktioner 10. Udviklingslandene bliver også brugt til stofmisbrug forskning for at løse ukendte mekanismer og veje såsom dem forbundet med alkoholafhængighed 11-14, narkotikamisbrug 13,15, og kombinationen af HIV-infektion og stofmisbrug 16-19. Disse igangværende undersøgelser og fremtidige undersøgelser In området immunologi gør in vitro generation af DC'er ekstremt vigtigt for forskning. Der er imidlertid adskillige vanskeligheder forbundet med at isolere DC'er fra humant blod som de kun udgør 0,1 - 1% af totale mononukleære blodceller 20.

Til dato er nogle af de veletablerede metoder til frembringelse af DC'er in vitro består af plast eller glas adhærens af monocytter 21,22, densitetsgradientcentrifugering 23, specifik markør baseret separation, såsom magnetisk cellesortering 22, fluorescerende cellesortering 24, positiv selektion af CD14 + monocytter under anvendelse dextran-coatede magnetiske nanopartikler 25 og hurtig isolering af højtoprensede monocytter under anvendelse fuldautomatisk negativ celleselektion 26. Imidlertid er den bedste metode til valg forbliver kontroversiel. Derfor, for at forbedre DC generation teknikker, er adskillige fremgangsmåder blevet udviklet, hvorirenheden af disse celler kan forøges meget ved differentiering fra oprensede CD34 + stamceller og monocytter isoleret fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) 27. Som nævnt før, en udbredt og populær metode til at generere monocytderiverede dendritiske celler (MDDCs) er at undersøge muligheden af monocytter til at holde sig til glas eller plast (vedhæftning metode) 21,22,27. Vedhæftningen metode er en hurtig og enkel metode, der ikke kræver anvendelse af kompliceret udstyr. Men nogle ulemper ved denne proces, omfatter lymfocyt kontaminering, lav fleksibilitet, og monocyt forbigående manipulation 28. En alternativ fremgangsmåde til overholdelse metode er den magnetiske isolation af monocytter fra total PBMC'er, især med anvendelse af en human monocyt berigelse kit, som er designet til at isolere monocytter fra PBMC'er ved negativ selektion 26. Under denne procedure, er uønskede celler målrettet til fjernelse med tetramertantistof-komplekser og dextran-coatede magnetiske partikler. Fordelen ved denne isolation fremgangsmåde er, at de uønskede mærkede celler separeres ved anvendelse af en magnet, mens målceller kan frit hældes ud i et nyt rør uden behov for kolonner. Til dato med tilgængeligheden af ​​specifikke monoklonale antistoffer, der kan oprette etiketter unikke cellepopulationer, har den magnetiske separation teknik bliver ikke blot en yderligere metode, men en nødvendighed for isolering af sjældne celler i området immunologi. For eksempel teknikker såsom magnetisk cellesortering med kommercielt tilgængelige paramagnetiske MACS-nanopartikler har lettet udviklingen af nye metoder til forskning og kliniske anvendelser 22,29. Desuden har nyere videnskabelige undersøgelser, der sammenligner DC generation fra monocytadhærens og MACS teknologiske metoder viste en højere DC renhed og levedygtighed ved hjælp af MACS adskilte monocytter 22,30.

Den aktuelle undersøgelse gaveren sammenligning mellem to metoder til generering af humane DC'er fra monocytter isoleret fra PBMC'er: 1) monocyt isolering ved adhærens og 2) monocyt isolering ved negativ selektion under anvendelse af et kommercielt humant monocyt berigelse kit. Denne undersøgelse giver bevis for, at den negative selektion magnetiske separation procedure for at isolere monocytter genererer det højeste udbytte af monocytter med ingen signifikante forskelle i monocyt levedygtighed sammenlignet med monocytter isoleret ved vedhæftning metode. Til gengæld, efter syv dage, monocytterne isoleret ved magnetisk separation differentieret til MDDCs med signifikant højere proliferativ kapacitet og højere mængde celler, der udtrykker dobbelt positive (CD11c + / CD14 +) fænotype uden at påvirke MDDC levedygtighed. Samlet er den nuværende undersøgelse adskiller sig fra de tidligere undersøgelser refereres ovenfor, da det viser evnen hos begge teknikker til samtidig generere monocytter, der er i stand til at proliferere og differentiere til CD11c +MDDCs (> 70%) efter syv dage i kultur uden at kompromittere deres levedygtighed. Hertil kommer, at nuværende tilgang giver for første gang karakterisering af forskellige CD11c / CD14 MDDCs befolkninger ved billedbehandling flowcytometri.

Sammenfattende da DC'er spiller et knudepunkt rolle vedrørende forskning inden for immunologi, skal der tages forskellige parametre i betragtning, når man overvejer, hvordan de er beregnet, samt hvilke metoder der bruges til at isolere og kultur dem in vitro. Derfor er denne undersøgelse har til formål at give indsigt på to forskellige metoder til monocyt isolation, og hvordan disse metoder differentielt påvirke monocyt levedygtighed og udbytte i sidste ende påvirker dendritiske cellers levedygtighed, proliferation og fænotype. Disse resultater vil i høj grad bidrage til området for immunologi og vil give en detaljeret protokol af DC isolation, rensning og karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samlet undersøgelser humant blod er blevet revideret og godkendt af Institutional Review Board (IRB) for FIU, IRB protokol godkendelse # IRB-13-0440. Humane leukopaks blev købt fra fællesskabet blodbank i Miami, FL.

1. Isolering af PBMC'er af Standard Density Gradient Teknik

  1. Udfør en 1: 1 fortynding af blod med 1x-phosphatbufret saltvand i en T75 kolbe.
  2. Afpipetteres 15 ml densitetsgradient opløsning i 50 ml centrifugerør og omhyggeligt lag (25 - 30 ml / rør) af det fortyndede blod i denne gradient.
  3. Centrifuger i 20 min ved 1200 xg med acceleration på 1 og deceleration af 0.
  4. Efter centrifugering, indsamle grænsefladelaget (hvide blodlegemer) i en ny 50 ml centrifugerør og vaskes cellerne to gange i PBS (3 min ved 1.080 xg). Supernatanten kasseres hver gang.
  5. Behandle celler med ammonium-chlorid-kalium lysering (ACK) puffer (til lysering af røde blodlegemer). Der tilsættes 10 ml buffer og icubate i 15 min ved 4 ° C.
  6. Vask cellerne to gange med PBS, centrifugeres i 3 minutter ved 1.080 xg og kassér supernatanten hver gang.
  7. Gem pillen, som vil indeholde de PBMC'er.
  8. Fortsæt med monocyt rensning metode.

2. Monocyt Rensning af Efterlevelse Method

  1. Forbered komplet celledyrkningsmedium indeholdende L-glutamin (300 mg / ml) og suppleret med penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) og 10% kalvefosterserum.
  2. Tillad PBMC'er adhærere i ca. 2 timer ved dyrkning deraf i et T75 kolbe i en koncentration på 5 x 10 7 celler pr 10 ml komplet medium ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
  3. Efter inkubation fjernes ikke-adhærente flydende celler fra dyrkningskolbe og forsigtigt vaske adhærente celler to gange med PBS.
  4. Inkuber adhærente celler i komplet celledyrkningsmedium suppleret med 2 pl / ml human granulocyt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin 4 (IL-4) opbevares ved en stamkoncentration på 10 ug / ml.
  5. Skift halvdelen af ​​mediet og genopbygge cytokiner hver 48 timer.
  6. Tillad 5 - 7 dage differentieringen af ​​monocytter i MDDCs.

3. Monocyt Oprensning ved magnetisk separation Metode

  1. Saml PBMC'er fra standard densitetsgradient teknik, hældes i en 5 ml polystyrenrør og resuspender i PBS-buffer i en koncentration på celler / ml.
  2. Tilføj human monocyt berigelse cocktail anvendelse af 50 pl / ml celler, bland godt og inkuber ved 4 ° C i 10 minutter.
  3. Efter inkubation tilsættes magnetiske partikler ved anvendelse af 50 gl / ml celler, bland godt og inkuber ved 4 ° C i 5 min.
  4. Bringe cellesuspensionen op til et samlet volumen på 2,5 ml ved tilsætning af PBS-buffer, bland godt ved pipettering op og ned 2 - 3 gange.
  5. Placer polystyrenrør uden en hætte i den magnetiske indretning og der er afsat ved stuetemperatur i 2.5 Min.
  6. Efter inkubation og i en kontinuerlig bevægelse, afhente magneten og hæld den ønskede renset monocytfraktionen i en ren 50 ml centrifugerør.
  7. Inkuber adhærente celler i komplet celledyrkningsmedium suppleret med 2 pl / ml human granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin 4 (IL-4) opbevares ved en stamkoncentration på 10 ug / ml.
  8. Hver 48 timer, ændre halvdelen af ​​mediet, spin ned på 1080 xg i 5 min og re-suspendere pellet med nye medier (cRPMI) og cytokiner.
  9. Tillad 5 - 7 dage differentieringen af ​​monocytter i MDDCs.

4. trypanblåt Udelukkelse levedygtighedsassayet

Bemærk: Brug denne teknik til at opnå celle udbytte og levedygtighed PBMC'er, monocytter, og MDDCs.

  1. Harvest celler under anvendelse standard trypsin-EDTA og udfører vask af kolberne, og cellepelleten anvendelse af PBS. Afhængig af størrelsen af ​​pillen, resuspendere 5 til 10 ml PBS for at opløse pelleten.
  2. I en mikro-centrifugerør, udføre en 1: 1 fortynding af trypanblåt-reagens med fortyndet cellepellet.
  3. Fra denne blanding, alikvote 10 pi i en celle tælle slide og læse resultaterne anvendelse af en automatiseret celletæller ifølge producentens protokol. Hvis en automatiseret celletæller ikke er tilgængelig, en lignende celletælling er muligt ved hjælp af et hæmocytometer eller en manuel tæller.

5. MTT assay

  1. Plate celler ved en koncentration på 4 x 10 4/100 pi komplette medier i hver brønd i en plade med 96 brønde. Tillad 24 timer for celler at tilpasse sig kulturen.
  2. Inkuber og udføre aflæsninger ved 0 (dag 0), 36 (dag 3) og 84 (dag 7) hr henholdsvis.
  3. Ved afslutningen af ​​ønsket inkubation fjernes mediet og erstattes med 100 pi PBS alene.
  4. Forbered 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromid-opløsning (MTT) (5 mg / ml) ved tilsætning af 10 ml dimethyl sulfoxid (DMSO) til 1 g natriumdodecylsulfat (SDS).
  5. Tilsæt 10 pi (5 mg / ml) af MTT-opløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i yderligere 2 timer.
  6. Efter inkubation fjernes supernatanter, der indeholder PBS og uomdannet MTT blanding (gul-farveopløsning).
  7. Tilsæt 100 pi SDS-DMSO-opløsning til hver brønd og inkuberes i en yderligere time.
  8. Absorbansen aflæses ved 540 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

6. CELLEOVERFLADEFARVNING Analyse af Imaging flowcytometri

  1. Efter 7 dages differentiering fra oprensede monocytter, dispensere 1x10 6 cell portioner af monocytafledte dendritiske celler i passende antal 1,5-ml rør.
  2. Start celleoverfladefarvning ved at blokere celler under anvendelse 50 pi varme inaktiveret (HI) humant serum, inkuberes ved 4 ° C i 10 minutter.
  3. Efter inkubation Centrifuger cellerne ved 720 x g i 5 min, kasseres supernatanten.
  4. Til celle pellet, tilsæt respektive fluorochrom-konjugerede antistoffer (f.eks, anti-CD11c eller anti-CD14) og inkuberes ved 4 ° C i 20 minutter beskyttet mod lys. I separate rør, forberede enkelt fluorokromkonjugerede farvede prøver / ml), da de er nødvendige for kompensation.
  5. Efter inkubation vaskes cellerne to gange i 1 ml PBS-buffer og centrifugeres hver gang ved 720 x g i 5 min.
  6. Holde celler beskyttet mod lys, resuspender i PBS-buffer i en koncentration på celler / 100 pi til flowcytometrianalyse.
  7. For at gate på levedygtige celler, tilsættes 1 ml af DAPI til hvert rør før erhverve cellerne på enkelt celle imaging flowcytometri instrument ifølge producentens anvisninger.

7. Statistisk analyse

  1. Input alle data i et regneark.
  2. Sammenligne resultater ved hjælp af t-test og / eller en-vejs ANOVA er relevant.
  3. Overvej forskelle at være statistisk signifikant, hvis p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monocyt Udbytte af Magnetic Separation er højere i forhold til Monocyt Udbytte af Efterlevelse Method

Data præsenteret i figur 1 display PBMC og monocyt celletal ved trypan udelukkelse metoden blå på dagen for isolering af PBMC'er og adskillelse af monocytter. I gennemsnit monocytter isoleret ved adhærens fremgangsmåde udgjorde ca. 6,2 procent af den samlede PBMC'er mens monocytter isoleret ved magnetisk separation udgjorde op til 25 procent af PBMC'er. Statistisk analyse viste, at procentdelen af ​​monocytter fremkommet ved magnetisk separation signifikant højere (≥ 4 gange). Data er udtrykt som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse ved anvendelse Students t-test viste en signifikant forskel på monocyt udbytte, når man sammenligner de to metoder (p ≤ 0,0005).

_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Monocyt Isolation ved Overholdelse og Magnetic Separation Påvirk ikke Monocyt Levedygtighed

Efter monocyt isolering ved de to forskellige ovenfor beskrevne teknikker blev levedygtighed assays udført for at sikre, at de anvendte metoder ikke var cytotoksiske og påvirke cellernes levedygtighed. Dataene præsenteret i figur 2 display gennemsnittet af procent af levedygtige monocytter isoleret ved enten vedhæftning eller ved magnetisk separation. Levedygtige celler blev talt under anvendelse af trypan ekskluderingsmetode på dagen for isolation blå. Sammenligning procent levedygtighed monocytter mellem de to isoleringsmetoder afslørede, at forskellen mellem de to grupper var ikke statistisk signifikant. Derudover gennemsnittet af procentdelen af ​​levedygtige monocytter isoleret ved adhærens var 91,75% ± 1,66 og gennemsnittet af procentdelen af ​​levedygtige monocytter isoleret ved MAGNietisk adskillelse var 87,4% ± 2,75. Disse levedygtighed data blev vurderet ud fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse t-test.

Celler afledt fra Monocytter isoleres ved Magnetic Separation viser en betydelig stigning i Cell Proliferation forhold til celler, der stammer fra Monocytter Erhvervet af Efterlevelse Method

MTT blev anvendt som en kolorimetrisk assay til måling af celleproliferation. I levende celler, er den gule tetrazol farve MTT reduceres til lilla formazan, som er let måles med et spektrofotometer. Dataene præsenteret i figur 3 viser, at begge processer monocyt isolation føre til højere celleproliferation over en periode på 7 dage som målt ved en forøget i absorbans ved dag 0 (adhærens metode: 0,22 ± 0,02 vs. magnetisk metode: 0,38 ± 00,02), dag 3 (overholdelse metode: 0,28 ± 0,02, magnetiske metode: 0,55 ± 0,05) og dag 7 (vedhæftning metode: 0,36 ± 0,01, magnetiske = 0,66 ± 0,006). Men i modsætning til XTT assay (data ikke vist), MTT-assayet viste en signifikant stigning i celleproliferation af MDDCs fra monocytter isoleret ved magnetisk separation i forhold til MDDCs fra monocytter erhvervet af adhærens metode på dag 0 (p = 0,003), dag 3 (p = 0,006) og dag 7 (p = 0,002). Celleproliferation blev også fundet at være signifikant forskellig mellem dag 0 og 3 (p = 0,003) og mellem dag 0 og 7 (p <0,001) i gruppen af ​​MDDCs fra monocytter oprenset gennem magnetisk separation. Desuden blev der observeret en signifikant forskel i celledeling mellem dag 0 og dag 7 i MDDCs fra monocytter renset ved vedhæftning (p = 0,008). MTT-assay blev udført under anvendelse MDDCs erhvervet fra tre forskellige eksperimenter. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af ANOVA og t-test, p ≤ 0,05 wsom betragtes som væsentlig, og p-værdier er noteret på grafen medmindre der ikke statistisk signifikans blev fundet.

Karakterisering af MDDCs ved CD11c og CD14 CELLEOVERFLADEFARVNING

Efter dyrkning monocytter i syv dage med IL-4 og GM-CSF, MDDCs opnået fra monocytter isoleret ved adhærens og magnetisk isoleringsmetoder blev karakteriseret i figur 4. Karakteriseringen afslørede lave enkelt CD14 + / CD11c- fænotype eller rent monocytisk population i begge metoder, vedhæftning = 1% ± 1,0 versus magnetisk = 1% ± 0,0 og høj samlet CD11c + fænotype, overholdelse = 72% ± 11 versus magnetisk = 79% ± 19. Men når den samlede CD14 + population blev analyseret yderligere, var der et højt udbytte af celler dobbelt positive for CD11 c og CD14 i begge metoder med magnetisk separation giver et højere antal CD11c og CD14 dobbelt positivpopulation sammenlignet med vedhæftningen metode, adhærens = 49% ± 7 versus magnetisk = 73% ± 15. Selv om der var et højere udbytte af MDDCs med dobbelt positiv fænotype via magnetisk separation, den CD11c positive og CD14 negative population af MDDCs blev højere i tilslutning metode; tilslutning = 23% ± 7 versus magnetisk = 6% ± 7. I figur 4B, den gennemsnitlige fluorescensintensiteten (MFI) af hver enkelt markør blev set på i låge befolkning og viste høj intensitet af CD14 i CD14 + population, svarende intensitet både CD11 c og CD14 i dobbelt positive population og høj CD11c intensitet i CD11c + og CD14- population. Sammenfattende selvom magnetisk isolering giver en højere procentdel af CD11c + / CD14 + celler, som kan være tidlige fase opdelte MDDCs, der endnu ikke faldet den monocytiske markør (CD14), vedhæftningen metode giver en højere procentdel af CD11c + / CD14-, som kan være et sent tidspunkt differentieret MDDC befolkning. I addition, DAPI-farvning blev udført for at bekræfte levedygtighed resultater og sikre karakterisering blev udført på levende MDDCs. Den procent af DAPI negative / levende celler (tilslutning = 76 ± 7 versus magnetisk = 67 ± 1), er ikke signifikant forskellig mellem de to metoder, der bekræfter begge metoder påvirker ikke levedygtighed MDDCs efter syv dage i kultur.

figur 1
Figur 1. Monocyt Udbytte ved magnetisk separation er højere sammenlignet med monocyt fangst inden Overholdelse Method. Omkring 6,2% af monocytter blev isoleret fra PBMC'er ved hjælp vedhæftningen metoden mens ~ 25% af monocytter blev opnået ved anvendelse af magnetisk separationsmetode. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse ved anvendelse t-test viste en signifikant forskel på monocyt udbytte, når man sammenligner de to metoder(p = 0. 00005). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Monocyt Isolering af Overholdelse og Magnetic Separation Påvirk ikke Monocyt Levedygtighed. Gennemsnittet af procent af levedygtige monocytter isoleret ved vedhæftning var 91,75% ± 1.66 og gennemsnittet af den procent af levedygtige monocytter isoleret ved magnetisk separation var 87,4% ± 2.75. Data er udtrykt som middelværdi ± SD procentuelle andel af levedygtige celler af mindst tre uafhængige forsøg. Ingen signifikant forskel blev observeret i celle levedygtighed, når man sammenligner de to rensningsmetoder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. celler fra Monocytter isoleret ved Magnetic Separation viser en betydelig stigning i Cell Proliferation forhold til celler, der stammer fra Monocytter Erhvervet ved Overholdelse metode. En betydelig stigning i absorbans blev observeret for begge metoder både dag 3 og dag 7, når man sammenligner de værdier mod sine respektive kontrol af dag 0. endvidere ANOVA og t-test viste også en signifikant forskel i absorbans på MTT-optagelse ved sammenligning begge metoder (p ≤ 0,05). Data er udtrykt som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

96 / 54296fig4.jpg "/>
Figur 4. Karakterisering af MDDCs ved CD11c og CD14 CELLEOVERFLADEFARVNING. A) Søjlediagram, der repræsenterer de forskellige populationer (% gated ud af enkelte celler). Først blev DAPI- (levende) celler gated fra de samlede enkeltceller. Derefter blev CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11 c + / CD14 + og CD11 c + / CD14- gated fra DAPI- (live) befolkning. CD11c + populationen er summation af to regioner CD11c + / CD14 + og CD11 c + / CD14-. B) Repræsentative grafer, der viser gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) med henblik på både CD11c og CD14 i hver subpopulation af celler. C) repræsentant scatter plots af celler mærket med CD11-APC og CD14-APCcy7 gatet på DAPI negative (levende) cellepopulation for både magnetiske og overholdelse metoder. Repræsentant billede galleri af enkelte celler (valgt i blå i scatter plots), der tilhører hver sub-population af celler, CD11c + / CD14- (gated i orange), CD11c + / CD14 + (gatedi rødt), og CD14 + (gated i lilla). I billedgalleriet af enkelte celler, den røde farve repræsenterer CD11c mærket med APC og gul farve repræsenterer CD14 mærket med APCcy7. I scatter plots, de valgte til gate befolkningerne farver er tilfældige og ikke korrelerer til den faktiske celle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Baseret på de kendte vanskeligheder isolere og generere MDDCs fra humant blod, nærværende undersøgelse havde til formål at give en samlet sammenligning af to veletablerede metoder til generering af MDDCs. Den første metode sammenlignes, er en velkendt metode til generering MDDCs ved at udnytte evnen hos monocytter at klæbe til glas eller plast (adhærens metode) 21,22,27. Vedhæftningen metode er hurtig og omkostningseffektiv, og kræver ikke anvendelse af komplekst udstyr. Men nogle ulemper ved denne proces, omfatter lymfocyt kontaminering, lav fleksibilitet, monocyt forbigående manipulation 22,30,31. Det andet alternativ metode sammenlignes, er den magnetiske isolation af monocytter fra total mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) ved anvendelse af en human monocyt berigelse kit 26, som er designet til at isolere monocytter fra PBMC'er ved negativ selektion. Fordelen ved denne isolation fremgangsmåde er, at uønskede cellermærkes og separeret under anvendelse af en magnet, mens målcellerne frit hældes ud i et nyt rør uden brug af søjler og uden direkte målretning af cellerne med antistoffer. Uanset monocyt isoleringsmetode (klæbende vs. magnetisk separation), efter at begge procedurer, en af de kritiske trin i protokollen er den in vitro-stimulering af monocytter med granulocyt makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-4 ( IL-4), som er nødvendige for at generere MDDCs. Dette er en almindelig og veletableret protokol til at generere MDDCs fra mononukleære blodceller uden at kompromittere antigenindfangning og forarbejdningskapacitet karakteristisk for umodne MDDCs 32. En af de store begrænsninger i de teknikker, der almindeligvis anvendes til in vitro generering af DC'er er det lave udbytte af precursorceller såsom monocytter. Som nævnt ovenfor, monocytter isoleret af vedhængningen metode udgjorde ca. 6,2 procent af den samlede PBMC'er, mens monocytter isoleret ved magnetisk separation udgjorde op til 25 procent af PBMC'er. Ifølge litteraturen, intervaller for differentiel hvide blodlegemer i normale voksne for monocytter er fra 2 - 10% 31 mens DC'er udgør blot 0,1 - 1% af totale mononukleære blodceller 20. Derfor kunne højt udbytte af monocytter (~ 25%) opnået efter magnetisk isolering skyldes urenheder af cellepopulationen og manglende antistof og / eller magnetisk partikel binding til uønskede celler.

For at opnå et højt udbytte og renhed af de isolerede monocytter, bør alle de kritiske trin i protokollen følges nøje. Under isolering af PBMC'er fra blod ved standard densitetsgradientcentrifugering, der er et par kritiske trin. Først, pipettering og omhyggeligt lagdeling af blodet over densitetsgradient opløsning i 50 ml centrifugerør er et trin, der kræver praksis siden pipettering hårdt kan forårsage blanding af denne opløsning og blod,hvilket kan føre til en svag PBMC lag, der er svært at isolere, eller det kan resultere i hele blandingen af ​​røde blodlegemer med PBMC'er. I dette trin er det vigtigt at opretholde en konstant og forholdsvis langsom strøm af pipettering at have en veldefineret lag af blod og en særskilt PBMC lag. Sekund, centrifugering i det næste trin med acceleration og deceleration 1 0 er meget kritisk. Hvis disse indstillinger ikke anvendes til det første centrifugeringstrin, vil det føre til blanding af blodet med densitetsgradient opløsning uregelmæssigt og vil ikke adskille PBMC'er fra resten af ​​blodkomponenterne. Det tredje er det vigtigt at inkubere PBMC'erne med ammonium-chlorid-Kalium (ACK) lyseringsbuffer i et længere tidsrum end den optimerede tid (10 - 15 min), eftersom længere inkubation med ACK kan føre til reduktion af levedygtige PBMC'er sammen med røde blodlegemer . Derudover er det også vigtigt at udføre de gange vask med PBS efter ACK inkubation. Men hvis de røde blodlegemer ikke lyseret med den førsteACK skridt, og de stadig fortsætte med at blive vist efter vask, er en anden runde af ACK lyserende stærkt anbefales.

Efter isolering af hvide blodlegemer, der er et par kritiske trin at huske på, når du udfører den tilslutning metode til at generere monocytter. Først afvaskning de flydende lymfocytter efter to timers PBMC'er inkubation er meget vigtigt, da tilstedeværelsen af ​​flydende lymfocytter kan forårsage færre monocytter at klæbe og kan også resultere i lavere MDDC renhed. Selv om disse vasketrin er kritiske, overdreven og barske vask (mere end anbefalet, dvs. to gange) kan forårsage afvaskning de adhærerende monocytter også, hvilket resulterer i lavere monocyt udbytte. For det andet, inkubering af celler med komplet medium og cytokiner er kritisk, da de cytokiner er ansvarlig for differentiering af monocytter til MDDCs. Desuden, skiftende medier og påfyldning cytokiner hver 48 timer er vigtigt for differentiering og overlevelse af cellerne. Mens skiftende medier, er det også afgørende at gemme de flydende MDDCs og returnere dem tilbage i kulturen sammen med friske medier og cytokiner da der er nogle MDDCs der kan løsnes fra overfladen under processen med differentiering. Det er også vigtigt at sikre, at monocytterne podes med den anbefalede koncentration, fastgjort og tætliggende fordi de har brug celle til celle-kontakt for at vokse. Ved udførelse af magnetisk separation metode til at generere monocytter, der er et par kritiske trin for at få et godt udbytte og høj renhed af monocytter. Først er det kritisk at opretholde cellekoncentrationen anbefales af producenten. Det er også vigtigt ikke at forstyrre polystyrenrør ved anbringelse i magneten, da det kan føre til mindre udbytte og mindre renhed. Som fremlagt ovenfor, denne teknik fører til en signifikant højere monocyt udbytte (figur 1) i forhold til vedhæftningen metode, som kan være relateret til tilstedeværelsen af andre calen. Endvidere, når cellerne blev karakteriseret ved flowcytometri, den magnetiske metode viser en højere procentdel af dobbelt positive celler (CD11c + / CD14 +), som kan korrelere med tilstedeværelsen af ​​andre celler eller kan også skyldes tilstedeværelsen af ​​forskellige stadier af MDDC differentiering.

Et andet vigtigt aspekt af in vitro MDDC generation uanset udbytte og renhed er evnen til at generere levedygtige og proliferative MDDCs. Den nuværende undersøgelse giver bevis for, at begge oprensningsfremgangsmåder inducere proliferation af MDDCs (figur 3) som vist ved stigningen i celle metaboliske aktivitet i syv dage i kultur. Derudover generering af MDDCs fra monocytter oprenset ved magnetisk separation viste en signifikant højere frekvens af proliferation sammenlign MDDCs genereret fra monocytter oprenset ved adhæsion (figur 3). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere litteratur demonstrerer, at generation af DC'er fra CD34 + celler er en proliferativ proces på grund af tilstedeværelsen af proliferative DC-progenitorer i humant blod 27, 33. Men der er kontroversielle fund påviser, at monocytter også kan differentiere til udviklingslandene uden tegn på spredning 34,35. Det er relevant at påpege, at der er en masse polemik om in vitro generation af DC'er og om hvorvidt DC'er genereres fra prolifererende forstadier eller fra differentiering af monocytter. For eksempel har in vitro produktion af DC fra adhærente perifere blodceller blevet vist at også berige for progenitorceller, der kan proliferation efter eksponering for GM-CSF 27 og der er også dokumentation for, at udbyttet af DC'er afledt i nærvær af GM-CSF og IL-4 kan ikke udvides udover antallet af udgangsmateriale monocytter 33. Samlet er den nuværende undersøgelse viser en forøget i proliferation af monocytic celler i kultur, der med syv dage resulterer i en alt MDDCs population med> 70% CD11c + fænotype (tilslutning = 72% ± 11 versus magnetisk = 79% ± 19). Det er relevant at påpege, at når udførtes yderligere fænotypisk analyse, men ikke signifikant, monocytterne isoleret ved magnetisk separationsmetode resulterede i MDDCs med en højere dobbelt positiv fænotype (adhærens = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + versus magnetisk = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), mens de monocytter isoleret ved adhæsion resulterede i MDDCs med en højere enkelt positiv fænotype (adhærens = 23% ± 7 CD11c + / CD14- versus magnetisk = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs med en højere dobbelt positiv fænotype (CD11c + / CD14 +) kan være under tidlige stadier af differentiering, mens MDDCs med en højere enkelt positiv fænotype kan være under sene stadier af differentiering.

Sammenfattende denne undersøgelse giver beviser til støtte, at den negative selektion magnetiske separation procedure at isolere monocytter genererer det højeste udbytte af monocytter med ingen signifikante forskelle i monocyt levedygtighed sammenlignet med monocytter isoleret ved adhærens metode. Til gengæld, efter syv dage, monocytterne isoleret ved magnetisk separation differentieret til MDDCs med signifikant højere proliferativ kapacitet og højere mængde celler, der udtrykker dobbelt positive (CD11c + / CD14 +) fænotype uden at påvirke MDDC levedygtighed. Når man sammenligner de to metoder, blev konklusionerne demonstreret evne begge teknikker til samtidig generere monocytter, der er i stand til at proliferere (figur 3) og differentiere (figur 4) ind CD11c + MDDCs efter syv dage i kultur siden begge metoder gav> 70% CD11c + MDDCs . yderligere analyse ser på modning markører, kan imidlertid vise sig nyttig for fuldt ud at karakterisere den funktionelle MDDC befolkning. Afslutningsvis begge metoder er fordelagtige alternativer til isolering af CD11c + MDDCs og provIde et passende udbytte for forskningsapplikationer og kan endda være nyttige for fremtidige kliniske anvendelser. Laboratoriet fokuserer i øjeblikket på generering af MDDCs at studere virkningerne af alkoholmisbrug og andre stoffer for misbrug på det medfødte immunsystem, i særligt evnen af ​​disse stoffer til at ændre MDDC fænotype og funktion. Derfor vil den aktuelle undersøgelse giver et udgangspunkt på MDDC karakterisering og styrke evnen til at gå videre med yderligere eksperimenter for at belyse de molekylære mekanismer medierende monocyt-afledte dendritiske celle funktion i forbindelse med stofmisbrug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

Tags

Immunologi Human monocytafledte dendritiske celler monocytter isoleringsteknikker immunsystemet magnetisk separation
Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, G., Parira, T., Laverde,… More

Figueroa, G., Parira, T., Laverde, A., Casteleiro, G., El-Mabhouh, A., Nair, M., Agudelo, M. Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols. J. Vis. Exp. (116), e54296, doi:10.3791/54296 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter