التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
تتبع نسيلي واحد والتحليل على مستوى كامل للقلب يمكن تحديد القلب السلوك خلية سلفية والتمايز خلال تطوير القلبية، والسماح لدراسة أساس الخلوية والجزيئية من التشكل القلب الطبيعي وغير الطبيعي. التقنيات الحديثة الناشئة من التحليلات نسيلي واحدة بأثر رجعي تجعل دراسة التشكل القلب في قرار خلية واحدة قابلة للتنفيذ. ومع ذلك، يتم زيادة التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء من القلب وعمق التصوير تعيق التصوير كله القلب في قرار خلية واحدة. للتغلب على هذه العقبات، ونظام المقاصة كامل الجنين التي يمكن أن تجعل القلب شفافة للغاية لكلا الإضاءة والكشف ويجب وضع. لحسن الحظ، في السنوات القليلة الماضية، تم الإبلاغ عن العديد من المنهجيات لأنظمة المقاصة كله الكائنات مثل وضوح، هيئة السلع التموينية جنيه، SeeDB، ClearT، 3DISCO، مكعب، قسم تعزيز الحدود، BABB وباكت. هذا المختبر هو مهتم في الآليات الخلوية والجزيئية للبطاقةIAC التشكل. في الآونة الأخيرة، أنشأنا النسب خلية واحدة تتبع عبر ROSA26-لجنة المساواة العرقية ERT2، ونظام ROSA26-النثار إلى خلايا التسمية قليلة خلال تطوير القلب. نحن تكييفها عدة منهجيات لازالة الجنين كلها بما في ذلك هيئة السلع التموينية جنيه ومكعب (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) لمسح الجنين في تركيبة مع جبل بأكمله تلطيخ لاستنساخ واحدة صورة داخل القلب. تم تصوير القلب بنجاح في قرار خلية واحدة. وجدنا أن هيئة السلع التموينية جنيه يمكن مسح قلب الجنين، ولكن لا يمكن مسح بشكل فعال القلب ما بعد الولادة، في حين CUBIC يمكن مسح قلب ما بعد الولادة، ولكن الأضرار قلب الجنين عن طريق إذابة الأنسجة. سوف الأساليب المذكورة هنا يسمح للدراسة وظيفة الجينات في قرار استنساخ واحد خلال التشكل القلب، والتي، بدورها، يمكن أن تكشف عن الأساس الخلوي والجزيئي لعيوب القلب الخلقية.
Introduction
التشكل القلب هو حدث متسلسل يتطلب تنظيم الزمانية المكانية من أربعة أنواع مختلفة من الخلايا الاصلية القلب في قطاعات متميزة من القلب، وأيضا يتطلب عدة شبكات تنظيمية الوراثية لتنظيم هذه العملية لتشكيل 1،2 القلب وظيفية. وينظم القلب مواصفات، والتمايز، الزخرفة، ونضوج غرفة من عوامل النسخ قلبية 3. طفرة جينية أو انحراف posttranscriptional هذه العوامل في الخلايا الاصلية في القلب يمكن أن يؤدي في أي الفتك الجنينية أو عيوب خلقية في القلب (CHD) 4. دراسة التشكل القلب تتطلب فهم التفاصيل الكامنة الهيكلية في ثلاثة أبعاد (3D) واحد وصفت القلب النسب خلية سلفية تتبع أثناء التطور القلب وتعزيز فهم التشكل القلب. وقد تم تطوير عدد من عالية الدقة القسم على أساس أساليب التصوير المقطعي في الالبريد الماضي بضعة عقود إلى صورة هيكل الجهاز 5،6. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب باهظة الثمن، والأدوات المتخصصة، والعمل المكثف، وتفتقر إلى التنظيم الهيكلي مفصلة في قرار خلية واحدة في الحجمي النهائي بناؤها صورة 7،8.
التصوير الحجمي 3D على مستوى خلية واحدة يوفر وسيلة لدراسة تمايز الخلايا السلف والسلوك الخلوية في الجسم الحي 7. ومع ذلك، لا يزال ضوء الأنسجة نثر العقبة الرئيسية أمام تصوير الخلايا والهياكل في 3D عمق قلب سليمة. الدهون هي المصدر الرئيسي للتشتت الضوء، وإزالة الدهون و / أو تعديل الفرق معامل الانكسار بين الدهون والمناطق المحيطة بها من النهج المحتملة لزيادة الشفافية الأنسجة 8. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد من الطرق المقاصة الأنسجة، مما يقلل من التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء، مثل BABB (الكحول البنزيل وbenzoat البنزيلالبريد خليط) وقسم تعزيز الحدود (رباعي هيدرو الفوران وdibenzylether)؛ ولكن في هذه الأساليب، لا يزال مضان تبريد قضية 8-10. المذيب تستند أساليب ماء، مثل SeeDB (الفركتوز / thioglycerol) و3DISCO (ثنائي كلورو ميثان / dibenzylether)، والحفاظ على إشارات الفلورسنت، ولكن لا تجعل الجهاز كله شفاف 7،8،11. في المقارنة، وضوح طريقة الأنسجة إزالة يجعل الجهاز شفافة، ولكنه يتطلب جهاز الكهربائي متخصص لإزالة الدهون 8،12، كما يفعل باكت (تقنية الوضوح السلبي)، الأمر الذي يتطلب أيضا هيدروجيل تضمينها 7،13. للحصول على معلومات مفصلة عن جميع طرق ازالة الأنسجة المتاحة، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 في ريتشاردسون ويختمن، وآخرون. 7.
في عام 2011، حماة وآخرون. اكتشف مصادفة خليط ماء "هيئة السلع التموينية جنيه" (اليوريا والجليسرول وتريتون X-100 خليط) أن يجعل دماغ الفأر وtranspar الجنينوالأنف والحنجرة مع الحفاظ تماما إشارات الفلورسنت من الحيوانات المستنسخة وصفت 14. وهذا يسمح لتصوير الدماغ سليمة على عمق عدة ملليمترات وإعادة البناء على نطاق واسع من السكان والتوقعات العصبية في قرار التحت خلوية. سوساكي وآخرون. زيادة تحسين هيئة السلع التموينية جنيه بإضافة aminoalcohols وضعت "مكعب" (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) طريقة إزالة الأنسجة، مما أدى إلى زيادة ذوبانية فوسفورية، وخفض الوقت المقاصة، ويسمح للمتعدد الألوان الفلورسنت التصوير 8. في هذه الدراسة، والاستفادة من هيئة السلع التموينية جنيه وتقنيات إزالة الأنسجة مكعب وعالية الدقة 3D باجتزاء البصرية، استنساخ الفردية داخل القلب أثناء تخلق القلب وتتبع باستخدام Rosa26Cre ERT2 15، R26R-النثار 16، αMHC-لجنة المساواة العرقية 17، cTnT-لجنة المساواة العرقية 18، </strong> Nfatc1-لجنة المساواة العرقية 19، وRosa26-mTmG (mTmG) 20 خطوط الماوس. مزيج من طريقة جبل بأكمله تلطيخ (WMS) وضعت سابقا 21،22 مع طرق إزالة الأنسجة يسمح كذلك إلى تلطيخ للبروتينات أخرى في استنساخ وصفت ولدراسة سلوكهم في سياق الحجمي 3D. مزيج من تطهير الأنسجة وWMS يسمح لفهم أفضل لدور الجينات والبروتينات المختلفة أثناء التطور القلب، والمسببات من عيوب خلقية في القلب. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة أخرى تمايز الخلايا السلف، والسلوك الخلوي، والأحداث الجهاز التشكل خلال التنمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل الجنين هو خطوة حاسمة جدا. الأجنة E9.5 هشة جدا وصغيرة الحجم، لذلك ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر على عدم الإضرار الهياكل جنين / القلب أثناء العزلة. يجب إزالة طبقات اضافية غير الجنينية يغلف الجنين / قلب بعناية خاصة عند تصوير الجنين كله. وهذا يسمح اختراق الأجسام المضادة والم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
