イメージングは、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
全心臓レベルで単一のクローン追跡および分析は、心臓の開発中に、心臓前駆細胞の挙動および分化を決定し、正常と異常な心臓の形態形成の細胞および分子基盤の研究を可能にすることができます。レトロスペクティブ単一クローン解析の最近の新技術は、実現可能な単一細胞の解像度で心臓の形態形成の研究を行います。しかし、撮像深さ、心臓の組織の不透明性と光散乱は単細胞解像度で妨げる全心臓イメージングを増加させます。これらの障害を克服するために、照明および検出の両方のための透明性の高い心をレンダリングすることができます全胚清算システムが開発されなければなりません。幸いなことに、ここ数年では、このようなCLARITYなどの全生物の決済システム、のSca ル 、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、DBE、BABBとPACTのための多くの方法が報告されています。このラボでは、カードの細胞および分子メカニズムに興味がありますIACの形態形成。最近、我々はROSA26-CreをERT2を経由してトレース単一細胞系統を確立し、ROSA26-紙吹雪システムまばらにラベル細胞に心臓の開発中に。私たちは、心の内の画像の単一クローンにホールマウント染色と組み合わせて胚をクリアするためのSca ルとCUBIC（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を含むいくつかの胚全体-クリアする方法論を適応しました。心臓が正常に単一細胞の解像度で画像化しました。私たちは、SCA ルは、胚の心をクリアすることができることを発見しましたが、組織を効果的に溶解することによって胚の心をCUBICは、生後の心をクリアすることができますが、生後の心をクリアしますが、損害賠償はできません。ここに記載される方法は、順番に、先天性心臓欠陥の細胞および分子基盤を明らかにすることができ、心臓の形態形成、間に単一クローンの解像度での遺伝子機能の研究を可能にします。
Introduction
心臓の形態形成は、心臓の別個のセクタに心臓前駆細胞の4つの異なるタイプの時空間組織を必要とし、また、機能的な心1,2を形成するために、このプロセスを調整するために、複数の遺伝子制御ネットワークを必要とするシーケンシャルイベントです。心臓の仕様、分化、パターニング、及びチャンバ成熟は心原性転写因子3によって規制されています。心臓前駆細胞の遺伝的変異またはこれらの因子の転写後収差は、胚性致死または先天性心臓欠陥（CHD）4のいずれかになる可能性があります。心臓の形態形成の研究では、3次元（3D）に固有の構造的な詳細を理解する必要がありますし、心臓の開発中にトレース単一ラベルされた心臓前駆細胞系譜は、心臓の形態形成の理解を促進します。高解像度の部分ベース断層撮影法の数が目に開発されています画像臓器構造5,6に数十年の過去の電子。しかしながら、これらの方法は高価で特殊な機器、広範な労働力を必要とし、最終的な体積再構成された画像7,8における単細胞解像度で詳細な構造組織を欠いています。
単一細胞レベルでの3Dボリュームイメージングは、 生体 7 に前駆細胞の分化および細胞の挙動を研究するための手段を提供します。しかし、組織の光散乱が深く、無傷の心の中の3Dでの細胞や構造を画像化する主要な障害となっています。脂質は、光散乱の主要な供給源であり、脂質および/または脂質およびその周辺地域との間の屈折率差の調整の除去は、組織透明8を高めるための潜在的なアプローチです。過去数年間で、組織のクリア方法の数は、組織の不透明度と光の散乱を低減しており、開発されたBABB（ベンジルアルコール、ベンジルbenzoatなどEの混合物）とDBE（テトラヒドロフラン、ジベンジル）;しかし、これらの方法では、蛍光消光が問題8-10まま。溶媒としては、例えばSeeDB（フルクトース/チオグリセロール）と3DISCO（ジクロロメタン/ジベンジル）などの親水性の方法を、ベースの蛍光シグナルを維持するが、7,8,11透明な臓器全体をレンダリングしません。比較では、CLARITY組織クリア方法は、透明な臓器をレンダリングするが、それはまた、7,13を埋め込むヒドロゲルを必要とする、PACT（パッシブ明確にする技術が）同じように、脂質8,12を除去するために、特殊な電気泳動装置を必要とします。利用可能なすべての組織クリアする方法に関する詳細情報については、 ら 、リチャードソンとリヒトマンの表1を参照してください。7。
2011年に、ハマらは偶然マウス脳と胚transparをレンダリングする親水性混合物」のSca ル 」（尿素、グリセロールおよびTriton X-100混合物）を発見しましたENT完全に標識されたクローン14からの蛍光シグナルを維持しながら。これは、無傷の数ミリメートルの深さで脳や細胞内の解像度でニューロン集団と突起の大規模な再構成の撮像を可能にします。須崎ら。さらにクリア時間を減少させ、リン脂質可溶化を増加し、多色蛍光イメージング8に許可された組織のクリア方法は、アミノアルコールを添加することにより、のSca ルを改善し、「CUBIC」（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を開発しました。本研究では、心臓の間に心の中のSca ルの利点とCUBIC組織決済技術と高解像度の3D光学切片、個々のクローンを取ることはRosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、cTnTの-のCreを使用して追跡しました18、 </strong> NFATC1-Creを 19、とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウス系統。ホールマウント染色（WMS）メソッドの組み合わせは、以前に21,22、さらに標識されたクローン中の他のタンパク質の染色のためにと3Dボリュームコンテキストで彼らの行動の研究のために許可された組織のクリア方法とを開発しました。組織のクリア及びWMSの組合せは、心臓の開発中の異なる遺伝子およびタンパク質の役割のよりよい理解を可能にし、先天性心臓欠陥の病因。このプロトコルは、開発中に、他の前駆細胞の分化、細胞の挙動、および臓器形態形成事象を研究するために適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
胚の分離は非常に重要なステップです。 E9.5胚ので細心の注意が単離中の胚/心臓の構造に損傷を与えないように注意する必要があり、サイズは非常に壊れやすいと小さいです。胚全体を撮像する場合、胚/心臓を包む非胚余分な層は、特に慎重に除去しなければなりません。これは、胚組織の奥深く抗体および清算混合物の浸透を可能にし、また、撮像する際のバックグラウンド信号を除去す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
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