Tredimensjonal Kultur analysen til Explore Cancer Cell Invasivitet og satellitt tumordannelse

Summary

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Abstract

Pattedyrcellekultur i monolag er mye brukt til å studere forskjellige fysiologiske og molekylære prosesser. Men denne tilnærmingen til å studere voksende celler genererer ofte uønskede gjenstander. Derfor cellekultur i et tre-dimensjonalt (3D) miljø, ofte ved hjelp av ekstracellulære matriks-komponenter, dukket opp som et interessant alternativ på grunn av sin nære likhet med det native in vivo vev eller organ. Vi har utviklet en 3D-cellekultursystem med to avdelinger, nemlig (i) en sentral del som inneholder kreftceller innleiret i en kollagen-gel som virker som et pseudo-primær macrospherical tumor og (ii) en perifer cellefri kammer laget av et fibrin gel, det vil si et ekstracellulært matrisekomponent forskjellig fra den som anvendes i midten, hvor kreftceller kan migrere (invasjon foran) og / eller dannelse av mikrosfærisk tumorer som representerer sekundære eller satellitt tumorer. Dannelsen av satellitt tumorer i det perifere kammer erbemerkelsesverdig korrelert til den kjente aggressivitet eller metastatisk opprinnelse av de innfødte kreftceller, noe som gjør denne 3D kultur systemet unikt. Denne cellekultur tilnærming kan anses for å vurdere kreftcelle invasivitet og motilitet, celle-ekstracellulær matriks interaksjoner, og som en metode for å evaluere anti-kreft legemidler egenskaper.

Introduction

Gransker de grunnleggende og biomedisinske egenskaper ved kreftcelle invasjon / migrasjon og påfølgende metastase etablering er gjenstand for en intens forskning ^1,2. Metastase er den ultimate stadium av kreft og dens kliniske behandlingen fortsatt ukjent. En bedre forståelse av metastaser på cellulære og molekylære nivåer vil muliggjøre utvikling av mer effektive behandlingsformer ^3.

Flere egenskaper av metastatiske celler kan utforskes in vitro ⁴ inkludert deres stemness og potensial til å skaffe seg en overgang tilstand (f.eks epithelioid-mesenchymale overgang) for å migrere og invadere i og fra den primære svulsten ^5. Imidlertid har den in vitro vurderingen av invasjons / metastaseprosesser vært en utfordring, siden det praktisk talt utelukker bidraget av blod / lymfatiske sirkulasjon. Organotypiske kulturer som embed tumorfragmenter i kollagen gels har previouslu blitt brukt til å overvåke kreft aggressivitet. Selv om kompleksiteten av tumorer er bevart (f.eks tilstedeværelsen av ikke-kreftceller), tumorfragmenter blir utsatt for begrenset diffusjon medium, for prøvetaking variasjon, og til en overvekst av stromale celler ^6. En alternativ metode består i voksende kreftceller innenfor komponenter i den ekstracellulære matriks (ECM), som etterligner den tredimensjonale (3D) cellemiljøet. Spredning av brystkreftcellelinjer i en kollagen-gel og / eller en basalmembran-avledet matriks er blant de best karakteriserte eksempler på 3D-cellekultur. Ved å bruke spesielle 3D cellekultur miljøer, kan uorganisert montering observert for brystkreft celler dyrket under standardbetingelser reverseres i den spontane dannelsen av melke acini og rørformede strukturer ^7-10. Videre er dannelsen av flercellede tumor sfæroider avledet fra adenokarsinom-cancerceller deltar ved hjelp av ulike teknikker (f.eks hengende dråper, flytende sfæroider, agar embedment) nå utgjør den mest brukte 3D-cellekultur-analyse ^11-13. Imidlertid er denne analysen begrenset av den begrensede sett av kreftcellelinjer som kan danne sfæroider og ved den korte perioden tilgjengelig for å studere celler i disse tilstandene.

I denne visualisert teknikken, vi heri innføre en sofistikert 3D-cellekultur-analyse hvor kreftcellene av interesse er innleiret i en kollagen-gel for å tillate in vitro dannelse av en pseudo-primærtumor som kan alternativt belegges med en basalmembran-avledet matrise. En gang er dannet, blir den pseudo-primær tumor deretter klemt i en acellulær matrise (fibringel i det foreliggende tilfelle), noe som gjør at kreftceller til å krysse grenseflaten mellom de to kamrene matriks (se figur 1). Interessant, sekundær tumor-lignende strukturer som stammer fra den pseudo-primærtumor sammen med aggressive kreftceller vises ifibringel. Et slikt 3D kultursystem gir den fleksibilitet som kreves for å undersøke, for eksempel anticancer legemidler, genekspresjon og celle-celle og / eller celle-interaksjoner ECM ^14-16.

Figur 1:.. Oversikt over Method Skjematisk oppsummering av metode for å generere 3D cellekultur system som modell for kreftstudier Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

MERK: Ingen etikk vurdering siden animalske og menneskelige kreftceller ble kjøpt eller ber gitt til oss. 1. Making Kollagen Plugger (Pseudo-primær tumor) Forbered en kollagen spredning. Type I kollagen fra rottehale sener (RGT) kan enten trekkes ut og sterilisert som tidligere rapportert 17, eller kjøpes. Spre frysetørret RTT kollagen (3,25-3,50 mg / ml i 0,02 N eddiksyre) ved hjelp av en blender (high-speed setting; fem 2 min løper) for en jevn blanding. Harvests (trypsin-E…

Representative Results

Som tidligere nevnt, en interessant trekk ved denne 3D-cellekultur-analyse er at kreftceller ikke bare kan migrere fra kollagen pluggen til den tilstøtende fibrin-gelen, men også etablere sekundære tumorer (for eksempel satellitt-tumor-lignende strukturer). Dette kan observeres direkte med et invertert fasekontrastmikroskop ved lave og høye forstørrelser gjennom gelen tykkelse, spesielt med en lang arbeidsavstand kondensator (figur 2). Ved hjelp av denne 3D…

Discussion

Som et viktig teknisk fotnote, er det avgjørende at ikke i noe gap er til stede på grenseflaten mellom det sentrale og det perifere geler. Ellers kan det redusere kapasiteten av cellene for å migrere / invaderer fibringel. Et mellomrom mellom kollagen og fibrin-geler kan dannes i løpet av den første 24-timers kultur hvis trombin ikke er passende fortynnet. Det er også mulig at cellelinjen testet kunne føre kollagen gelen for å trekke seg sammen i løpet av kulturen, for derved å forårsake en forholdsvis stor p…

Materials

Freeze-dried collagen	Sigma-Aldrich	C7661	from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogen (freeze-dried)	Sigma-Aldrich	F8630	Type I-S, 65-85% protein with ≥75% of protein is clottable
Thrombin	EMD Chemicals Inc.	605157	Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356234	Previously from BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)
Micro-spoons	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96 well plate, round base	Sarstedt	3925500
24 well plate	Sarstedt	3922
Dulbecco's modified Eagle's Medium	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
Fetal Bovine Serum	VWR	CAA15-701	FBS, Canadian origin.
Trypsin-EDTA	Sigma Chemical, Co.	T4049
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Chemical, Co.	H8264	HBSS