Hücresel Termal Etkileri İncelemek İçin Kültür Hücrelerini Isıtma İçin Sürekli Dalga Tribün Lazeri
Summary
1.94 μm sürekli dalga lazer radyasyonunu kullanarak bir kültür çanağındaki hücreleri ısıtmak için orijinal bir deney düzeneği burada tanıtıldı. Bu yöntemi kullanarak, farklı termal pozlamalardan sonra retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin biyolojik cevapları araştırılabilir.
Abstract
Biyolojik değerlendirme için 1.94 mikronluk sürekli dalga tulium lazer kullanılarak kültürlenmiş hücreleri ısıtmak için özgün bir yöntem buraya girilmiştir. Tülyum lazer radyasyonu su ile kuvvetli bir şekilde emilir ve kültür çanağının altındaki hücreler termal difüzyon yoluyla ısıtılır. 365 μm'lik bir çapa sahip bir lazer fiber, herhangi bir optik olmadan kültür çanağının yaklaşık 12 cm üzerinde ayarlanır, böylece lazer ışını çapı, kültür çanağının (30 mm) iç çapıyla neredeyse eşdeğerdir. Her deneyde tutarlı bir miktarda kültür ortamı tutarak, hücreleri çok tekrarlanabilir sıcaklık artışı ile ışınlamak mümkündür.
Sıcaklık artışını ve her güç ayarı için bir hücre kültürü çanağındaki dağılımını kalibre etmek için sıcaklık, farklı konumlarda ve hücresel düzeyde 10 saniye boyunca ölçülmüştür. Sıcaklık dağılımı, matematik grafik yazılımıProgramı ve kültür örneğindeki örneği Gauss formunda idi. Lazer ışınlamasından sonra, sıcaklığa bağlı hücre yanıtlarını değerlendirmek için farklı biyolojik deneyler gerçekleştirilebilir. Bu el yazmasında canlı apoptozis ve ölüm zamanlarındaki farklı noktalardan sonra ölüm sıcaklıklarının belirlenmesine yardımcı olmak için canlılık boyaması ( yani, canlı, apoptotik ve ölü hücreleri ayıran) tanıtıldı.
Bu yöntemin avantajları, sıcaklığın ve ısıtmanın zamanının hassaslığı ve aynı zamanda bir hücre kültürü çanağındaki ısıtma hücrelerindeki yüksek verimliliğidir. Ayrıca, bilgisayarlı bir işletim sistemi tarafından iyi kontrol edilebilen çok çeşitli sıcaklıklar ve zaman süreleri ile çalışma yapılmasına olanak tanır.
Introduction
Sıcaklığa bağlı hücre biyolojik tepkilerini anlamak, başarılı hipertermi tedavileri için büyük önem taşır. Oftalmolojide kullanılan termal lazerli retina lazer fotokoagülasyon, tıpta en köklü lazer tedavilerinden biridir. Görünür ışık, çoğunlukla yeşil-sarı dalga boylarına, retinal lazer tedavisinde kullanılır. Işık retinal pigment epitelyal (RPE) hücrelerindeki melanin yüksek derecede emdiği retinanın en dıştaki hücre tek tabakasını oluşturur. Farklı retina bozuklukları türleri için yeni bir terapötik strateji olarak doktorlar ve araştırmacılar arasında son derece ilginç bir ışık ısısı ışınlaması (görünmeyen fotokoagülasyon) bulunmaktadır 1 , 2 . Bu eğilimi takiben, sıcaklık kontrollü fototermal terapi (TC-PTT) adı verilen bir teknik olan hassas sıcaklık kontrolü altında RPE hücrelerini ölümcül derecede ısıtmaktadır.
Son optoEnstitümüzden akustik teknoloji, retina ışınlanmış bölgelerdeki sıcaklık artışlarının gerçek zamanlı ölçümüne izin verdi. Bu, ışınlama sırasında sıcaklık artışının kontrolü sağlar 3 . Bununla birlikte, RPE hücrelerinin ölümcül derecede ısıtılmasından kaynaklanan, retina üzerine ölümcül olmayan hipertermi, sıcaklığın ölçülmesi ve kontrol edilememesi nedeniyle daha önce düşünülmediğinden termal lazer ışınlamasını takiben RPE hücrelerinin sıcaklığa bağlı hücre yanıtları Bugüne kadar çok az çalışılmıştır. Dahası, sıcaklık farkı ayrıntılı olarak tartışılmakla kalmamakla birlikte, ölümcül ve ölümcül ışınlama sonrasında hayatta kalan hücrelerin hücre davranışındaki farkı da tartışmamaktadır. Bu nedenle, TC-PTT'ye dayalı tedaviler hakkında bilimsel kanıt toplamak için, sıcaklık bağımlı RPE hücresi biyolojik tepkilerini ve bunların in vitro deney düzeneklerini kullanarak mekanizmalarını aydınlatmayı amaçlıyoruz.
Kale1) hızlı sıcaklık artışına, 2) hassas bir şekilde kontrol edilen zaman ve sıcaklığa ve 3) biyolojik deneyler için nispeten yüksek sayıda incelenen hücreye gereksinim duyan bir hücre ısıtma düzeneğinin kurulması gereklidir. . Isıtma yöntemi ile ilgili olarak, frekans katlamalı Nd.YAG lazer (532 nm) gibi klinik bir lazer, ne yazık ki hücre kültürü ısıtması için uygun değildir. Bunun nedeni, kültür RPE hücrelerindeki melanozomların sayısının çok az olmasıdır. Lazer ışığı emilimi homojen olmayabilir ve hücresel seviyedeki sıcaklık artışı, aynı radyasyon enerjisi ile ışınlansa bile deneyler arasında değişkenlik göstermektedir. Daha önceki bazı araştırmalar ışınlama 4 sırasında bulaşık dipinin altında siyah kağıt kullandığını veya 5 , 6 deneyleri öncesinde kültür hücreleri tarafından fagositize edilen ek melanozomların kullanımını bildirmiştir. ÇoğuHipertermi kaynaklı hücre tepkilerini değerlendirmek için in vitro biyolojik çalışmalar, sıcak bir tabla, bir su banyosu veya sıcaklık ayarı olan bir CO 2 inkübatör kullanılarak gerçekleştirildi. Bu yöntemler, istenen sıcaklığa erişmek biraz zaman ( yani birkaç dakika) alması nedeniyle uzun bir ısıtma periyodu gerektirir. Dahası, bu yöntemleri kullanarak, hücresel düzeyde detaylı bir termal öykü ( yani, sıcaklık zamanla çarpılan sıcaklık) elde etmek zordur. Dahası, bir kültür çanağındaki farklı konumlardaki hücreler arasındaki sıcaklık, değişken sıcaklık difüzyonundan dolayı farklılık gösterebilir. Çoğu vakada, hipertermi sırasında bu geçici ve uzaysal sıcaklık bilgileri, biyolojik hücre tepkisi artan sıcaklığın sıcaklığı ve süresi ile kritik olarak etkilense bile, biyolojik analizler için dikkate alınmamıştır.
Bu sorunların üstesinden gelmek içinHücreleri ısıtmak için nuts dalga tulium lazer kullanıldı. Tülium lazer radyasyonu (λ = 1.94 μm) su 8 tarafından kuvvetle emilir ve kültür çanağının altındaki hücreler termal olarak sadece termal difüzyon yoluyla uyarılır. 365 μm çaplı lazer elyafı, kültür çanağının yaklaşık 12 cm üstünde, herhangi bir optik olmadan aralarında bulunur. Lazer ışını çapı, kültür ortamının yüzeyindeki kültür çanağının (30 mm) iç çapıyla neredeyse eşdeğer olacak şekilde diverjiktir. Tutarlı bir miktarda kültür ortamı ile, hücreleri sıcaklık artışıyla ışınlamak mümkündür Yüksek tekrarlanabilirlik. Değişken güç ayarları 20 W'a kadar ışınlamayı mümkün kılar ve hücresel seviyedeki orta sıcaklık 10 saniyede ΔT ≈ 26 ° C'ye kadar yükseltilebilir.
Işınlama koşullarını değiştirerek, sıcaklık dağılımını değiştirmek için lazer ışını profilini değiştirmek de mümkündürBir kültür çanağında. Örneğin, mevcut çalışmadaki gibi Gauss benzeri sıcaklık dağılımıyla veya homojen bir sıcaklık dağılımıyla araştırmak mümkündür. İkincisi, sıcaklığa bağlı hücre yanıtlarının ölümcül olmayan sıcaklık artışları için daha spesifik olarak etkilerini araştırmak için avantajlı olabilir, ancak hücre ölüm stresinde veya yara iyileştirme yanıtlarında geçerli değildir.
Tülyum lazer ışınlaması, farklı termal pozlamalardan sonra gen / protein ifadesi, hücre ölüm kinetiği, hücre çoğalması ve hücre işlevsellik geliştirme gibi farklı biyolojik faktörlerin araştırılmasını sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıcaklığa bağlı biyolojik hücresel tepkileri tartışırken, çoğu biyokimyasal süreçler zamana bağlı olduğu için sadece sıcaklık değil artan sıcaklığın süresi de önemlidir. Özellikle oftalmolojideki lazerle indüklenen hipertermi alanında, milisaniyeleri ile saniyeler arasındaki kısa zaman aralıklarından dolayı, hassas sıcaklık kontrolü ile hücresel termal etkileri araştırmak zordur. Bu nedenle, hücre kültürü modeline uygun ve sıkı sıcaklık ve zaman kontrolü sağlayan bir ça…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) (hibe # 13GW0043C) ve Avrupa Uzay Araştırma ve Geliştirme Ofisi (EOARD, hibe # FA9550-15-1-0443) tarafından yapılan bir araştırma yardımıyla desteklendi.
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
