زرع تنافسية لتقييم المكونة للدم للياقة الخلايا الجذعية
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
تكون الدم هو عملية التجدد الذي يضمن يشير استكمال خلايا الدم التي فقدت بسبب الاصابة، والإشعاع وموت الخلايا. وتكفل هذه العملية عن طريق الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) الموجودة إلى حد كبير في نخاع العظام الكبار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية المكونة للدم يمكن أن تستخدم لأغراض علاجية في اضطرابات المناعة الذاتية، والأورام الخبيثة الدموية ونقص المناعة 1. وبالتالي فإن هناك حاجة إلى فهم أفضل للآليات التي تنظم وظيفة شهادة الثانوية العامة، بما في ذلك توسيع التكاثري، وقدرتها على الوصول إلى وتدبر نخاع العظام المتلقي بعد زرع. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت مؤخرا وأفادت العديد من علامات سطح الخلية، بما في ذلك أفراد الأسرة SLAM CD150 وCD48، لإثراء مستقبلي HSCs الكبار وHSCs الجنين إلى ما يقرب من 50٪ نقاء 2-4، وقياس معيار الذهب للHSCs وظيفي لا يزال مقايسة في الجسم الحي إعادة إسكانها ل تحديد قدرتها على إعادة بناء الدم جإنتاج الذراع في مضيف المشع 5.
وقد وضعت في الجسم الحي نسيلي إعادة إسكانها فحص البداية حتى ومكولوتش 6 ومنذ ذلك الحين تم تنقيح وتوسيع نطاقها. كما هو محدد في الأصل، HSCs ضمان مدى الحياة إنتاج خلايا الدم من خلال تجديد الذات والتمايز. نقل HSCs إلى مستلم المشع مما يسمح لنا بتقييم: قدرتهم على التمييز من خلال تحليل مختلف الأنساب خلايا الدم (الخلايا اللمفية تي، الخلايا الليمفاوية B، المحببة، وحيدات) وقدرتها على التجديد الذاتي من خلال زرع التسلسلي. ان الفحص عادة ما تنطوي على المقارنة بين وظيفة و / أو كمية من اثنين من السكان من HSCs، على سبيل المثال، خلايا القادمة من اثنين من الفئران من المورثات أو الخلايا المختلفة التي تم التعامل أو غير المعالجة مع العوامل المختلفة التي يمكن أن تؤثر على صيانة أو توسعة HSCs في الثقافة. الخيمرية المانحة، أو مساهمة نقل المانحة HSCs رس إنتاج خلايا الدم ومن ثم يمكن تحديدها من قبل تحليل التدفق الخلوي في الدم المحيطي ونخاع العظام باستخدام علامات سطح الخلية أو وسائل أخرى من شأنها أن تميز الخلايا المانحة من المتلقي، أو المضيف. علامات الأكثر استخداما على نطاق واسع هي بالتأكيد الاليلين لجين Ptprc أو مستضد CD45 الكريات البيض 7 الذي اخترناه لالأمثلة الواردة أدناه.
وإعادة تعمير فحص نسيلي يمكن أن تكون تنافسية أو غير تنافسية. في وضع غير تنافسي، يتم نقل السيطرة واختبار HSCs في الفئران المتلقي منفصلة وستكون النتيجة لكل نوع من الخلايا أن يكون مستقلا عن الآخر. في وضع تنافسي، ويتم قياس وظيفة كل من اختبار ومراقبة HSCs ضد السكان من منافس HSCs. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الإعداد تنافسية ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لحالات غير تنافسية. كلا النهجين لها مزاياها وحدودها، ونحن سوف مقارنتها بالتفصيل فينقاش. نحن أيضا وصف أساليب مختلفة لضمان العدالة في عدد من HSCs المزروعة، وشرح كيفية التكيف مع الفحص لتقدير حجم HSCs من فحص تخفيف الحد (LDA)، وتقديم أمثلة على كل من زرع الناجحة وغير الناجحة لتفسير النتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لتقييم اللياقة البدنية النسبية للمانحين (اختبار) HSCs ضد منافس يعرف HSCs. وضع المنافسة يزيد من حساسية النسبية للفحص (أكثر عرضة للكشف عن انخفاض معتدل في اللياقة البدنية الخلايا الجذعية) ويوفر الرقابة الفنية الداخلية لفعالية التشعيع والحق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لروكسان هيتو-أربور للمساعدة في تصميم الشكل ومظاهرة من الإجراءات. وأيد البحوث في المختبر من قبل جائزة الانتقال من مؤسسة كول، ديسكفري منح لا. 419226-2012 من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (صندوق قادة CFI منح رقم 31377). KMH هو جديد Chercheur-Boursier لفون للبحوث كيبيك – سانتيه (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
