Приготовление и применение Органотипической тимуса срез культуры
Summary
Описано получение тимуса срезов, которые, в сочетании с проточной цитометрии, могут быть использованы для моделирования позитивной и негативной селекции развития Т-клеток. Тимуса ломтики также могут быть адаптированы для на месте анализа тимоцитов миграции, локализации и сигнализации с помощью иммунофлуоресценции и двухфотонной микроскопии.
Abstract
Тимуса продолжается отбор в уникальной и высоко организованной тимуса микросреды приводит к генерации функционального, само толерантные Т – клеточного репертуара. В пробирке модели для изучения T коммитирование и развития предоставили ценную информацию в этом процессе. Тем не менее, эти системы не имеют полную трехмерную тимуса среду , необходимую для развития Т – клеток и, следовательно, являются неполными аппроксимации тимуса селекции в естественных условиях. Некоторые из проблем , связанных с развитием моделирования Т – клеток может быть преодолена путем использования в моделях на места , которые обеспечивают интактного тимуса микросреду , который полностью поддерживает тимуса выбор развивающихся Т – клеток. Тимуса культуры ломтик органотипической дополнение к существующим методам в точке. Тимуса ломтики сохранить целостность тимуса коркового и мозгового регионов и обеспечить платформу для изучения развития накладными тимоцитах определенной стадии развития или эндогенного Т сгезов внутри зрелого тимуса микросреды. Учитывая способность генерировать ~ 20 срезов на мышь, тимуса ломтики представляют собой уникальное преимущество с точки зрения масштабируемости для высокопроизводительных экспериментов. Кроме того, относительная легкость в создании тимуса срезов и потенциал для наложения различных подмножеств тимуса или других клеточных популяций из разных генетических фонов повышает универсальность этого метода. Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов, изоляции и наложения тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии. Эта система также может быть адаптирована для изучения развития нетрадиционного Т-клеток, а также визуализировать тимоцитов миграции, тимоцитов-стромальных взаимодействий клеток и TCR сигналов, связанных с вилочковой селекции с помощью двухфотонной микроскопии.
Introduction
Т – клетки дифференцируются через ряд промежуточных развития в тимусе , во время которого они сталкиваются несколько контрольно – пропускных пунктов , которые обеспечивают формирование функциональной, само толерантные Т – клеточного репертуара 1-3. Положительный отбор способствует выживанию тимоцитов с рецепторами Т – клеток (TCR) , способных распознавать, с низкой до умеренной аффинностью, пептида , представленные главного комплекса гистосовместимости (MHC молекул) на корковых тимуса эпителиальных клеток (CTEC) 2,3. Отрицательный отбор и развитие клеток регуляторных Т (Т р) способствовать созданию аутотолерантности через ликвидацию или утечки тимоцитов , которые сильно реагируют на само-пептида , представленного MHC 2,4. Незрелые CD4 + CD8 + двойной положительный (DP) тимоцитов выражения ТКО , которые проходят процесс отбора дифференцируются в зрелые субпопуляции Т – клеток, большинство из которых являются MHC класса I-ограниченный CD8 + цитотоксическихили МНС класса II с ограничением CD4 + хелперов одиночных положительных (SP) Т – клетки, перед выходом из тимуса выполнять эффекторные функции во вторичных лимфоидных органах 1-3.
Добавление к сложности развития Т – клеток является динамическая миграция и клеточные столкновения развивающихся тимоцитов в рамках всей сети стромальных клеток 5-9. Эти стромальные клетки играют различные роли в развитии тимоцитов и дифференциально распределены между тимуса коркового и мозгового регионов , где положительные и отрицательные отбор происходят 10. Хотя положительный отбор происходит в основном в коре головного мозга, есть накопление доказательств того, что DP тимоциты мигрируют в костный мозг и продолжают требовать сигналов TCR, прежде чем они дифференцируются в зрелые Т-клетки, предполагающих, что продолговатый может предоставлять дополнительные сигналы, необходимые для завершения положительного отбора и линии дифференциация 11,12. В дальнейшем,несмотря на наличие специализированных медуллярных тимуса эпителиальных клеток (Mtec) , которые выражают и присутствующих тканей с ограничением антигенов , способствующих удаления аутореактивных тимоцитов 13,14, большая часть негативной селекции происходит в коре головного мозга в ответ на Повсеместно выражали себя пептид , представленный дендритные клетки 15,16. Таким образом, точные модели развития Т-клеток должны обеспечивать высокоорганизованной тимуса микросреду, с неповрежденной коркового и мозгового областей, что облегчает взаимодействие между тимоцитов и стромальных клеток, а также поддерживает миграцию тимоцитов, как эти клетки подвергаются позитивной и негативной селекции.
В дополнение к экс виво анализ тимоцитов в качестве средства изучения позитивной и негативной селекции, ряд ин витро, на месте, и в естественных условиях модели развития Т – клеток, были разработаны 17-22. Это было известно, трудно резюмироватьположительный выбор в пробирке, но сокультивирования популяций стволовых клеток или предшественников Т – клеток с стромальных клеток , экспрессирующих лиганд Notch, в частности OP9-DL1 4 клеток /, имеет возможность поддерживать T коммитирование и ограниченный положительный выбор делает его незаменимым в пробирке модель для исследование развития Т – клеток 23-25. Ограничения этой системы, однако, включают в себя тот факт, что эти клетки лишены уникальной обработки пептидный машины нашли в вилочковой стромальных клеток и трехмерную тимуса микросреду.
Хотя технически более громоздким, на месте и в естественных условиях модели тимуса отбора могут преодолеть некоторые из барьеров , связанных с системами в пробирке. Перегруппировываться тимуса культуры органов (РИПЦ) содержат определенные смеси тимоцитов и тимуса стромальных клеток 18,26,27. Эти тимуса эпителиальные reaggregates клеток поддерживать экспрессию класса I и II MHC и может поддерживать developmeнт как обычных подмножеств Т-клеток, но все еще не имеют определенные коркового и мозгового структур. Эмбрионального тимуса органной культуры (FTOC) является популярной моделью развития Т – клеток , которые могут быть посеяны с тимоцитов через висячей капле культуры lymphodepleted тимуса долей или через инъекции тимоцитов в lymphoreplete тимуса долей и поддерживать эффективное развитие CD4 + и CD8 + T клетки с течением времени в культуре 18,28-31. В начала культивирования эмбриональных тимуса долей существует недостаток mTECs, но определенные коркового и мозгового структуры могут развиваться с течением времени в зависимости от условий. Важным моментом является то, что эта модель может преимущественно поддерживать плода по сравнению с развитием взрослых Т-клеток. Наконец, внутритимусной инъекция определенных предшественников тимуса у взрослых мышей является технически сложной задачей, но очевидно, обеспечивает среду для поддержки Развитие Т – клеток в естественных условиях. Они на месте и в естественных условиях модели являются отличными инструментами то развитии исследования Т-клеток и их использование должно рассматриваться на основе эксперимента, по-эксперимента.
Тимуса ломтики, тем не менее, в последнее время появились в качестве универсального, комплементарной модели для исследования тимуса выбор на месте с возможностью размещения уникальной, сложной и в целом выше экспериментов пропускной способности . Тимуса ломтики сохранить целостность коркового и мозгового вещества регионов и обеспечить основу для стромальных клеток , которая поддерживает миграцию тимоцитов в процессе развития, а также эффективной позитивной и негативной селекции 11,32-39. Тимоцитов подмножества добавлены на вершине тимуса ломтиками мигрируют в ткани и их соответствующей нише микросреды 34,37. Накладываемого тимоцитов можно отличить от тимуса срезов эндогенных клеток с помощью конгенных маркеров или флуоресцентных меток и может поддерживаться в культуре в течение нескольких дней. Тимуса срез органотипической культуры могут быть использованы для изучения различных аспектовразвития Т-клеток, включая отбор тимуса, поведение тимоцитов (миграция и клеточных взаимодействий), а также локализации тимоцитов, среди других. Учитывая способность генерировать ~ 20 тимуса ломтиков на мышь, масштабируемость экспериментов , как правило , больше , чем другие в моделях натурных тимуса селекции. Хотя подготовка тимуса срезов требует специального оборудования, такого как vibratome, а срок службы тимуса срезов в культуре ограничено из-за потери клеток с течением времени через гибель клеток и отсутствие инкапсулирования мембраны, тимуса срезы обеспечивают отличную модель для анализа тимуса выбора синхронизированных популяций тимоцитов в зрелом тимуса микросреды. Здесь мы опишем приготовление тимуса срезов (включая заготовки тимус, агароза вложение тимуса долей и vibratome секционирования внедренного ткани), выделение и наложение тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов и репрезентативных результатов эффективной позитивной и негативной селекции накладным предварительного отбора I-ограниченный TCR трансгенных тимоцитов класса MHC с помощью проточной цитометрии. Эта система была использована с таки…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
