Summary
En effektiv och enkel metod för att datorbaserad analys av nematod simbeteende i flytande beskrivs. Metoden kräver liten eller ingen investering för C. elegans laboratorier. Hårdvaran som används är standard, och programvara för beteendeanalys (Celest) är en öppen källkod en.
Abstract
Dissekera neuronala och neuromuskulära kretsar som reglerar beteende fortfarande en stor utmaning i biologi. Nematoden Caenorhabditis elegans har visat sig vara en ovärderlig modellorganism för att hjälpa att ta itu med denna utmaning, från inspirerande tekniska metoder, bygga den mänskliga hjärnan connectome, faktiskt belysa de specifika molekylära förare av grundläggande funktionella mönster. Huvuddelen av de beteendestudier i C. elegans har utförts på fasta substrat. I flytande form, djur uppvisar beteendemönster som inkluderar rörelse i ett hastighetsområde i 3D, liksom partiella kroppsrörelser, såsom en bakre curl utan främre formförändring, som inför nya utmaningar för kvantifiering. Stegen i en enkel procedur och användning av en programvara som möjliggör hög upplösning analys av C. elegans simma beteende, presenteras här. Mjukvaran, som heter Celest, använder en specialiserad datorprogram som spårarflera djur samtidigt och ger nya åtgärder för C. elegans förflyttning i flytande (simning). Åtgärderna mestadels jordade i djur hållning och bygger på matematik som används inom datorseende och mönsterigenkänning, utan beräkningskraven för tröskel cut-off. Programverktyget kan användas för att både bedöma de samlade simning skicklighet i hundratals djur från blandade små serier försök och för att avslöja nya fenotyper även i väl karakteriserade genetiska mutanter. Framställningen av prover för analys med CELEST är enkel och låg-tech, vilket möjliggör bred anpassning av det vetenskapliga samfundet. Användning av beräknings metod som beskrivs här bör därför bidra till större förståelse för beteende och beteende kretsar i C. elegans modell.
Introduction
Definiera hur genetik, epigenetik, erfarenhet och miljö påverkar beteendet är en stor utmaning i modern biologi. Enkla, genetiskt mottagliga modeller som kan beräknings spåras och mäts kan göra kritiska bidrag mot detta mål. Nematoden Caenorhabditis elegans är en sådan modell. Syftet med denna artikel är att visa hur C. elegans simning förflyttning kan spåras och kvantifieras för att extrahera information om åtta nya funktioner med biologisk relevans.
C. elegans har en relativt kort livslängd av ca 2-3 w och en reproduktiv period av cirka 4 d vid 20 ° C 1,2. I standardlaboratoriekulturer, är denna mikroskopiska nematod odlas på petriskålar innehållande Nematode Growth Media (NGM) som är spridda med en bakteriell födokälla 3,4. WT N2 djur rör sig aktivt i eleganta sinusvågor på agar-fyllda plattor; de ändrar rörelse råttaes vid roaming (mat sökande), bostad (surfar), eller återhämta sig från en måltid (inaktiv mättnad inaktivitet) 5. Njurfunktion 6 eller ålder 7-12 kan också dramatiskt förändra rörelse på plattor.
Gener som modulerar beteende, healthspan eller åldrande, kan funktionellt karaktäriseras genom att analysera C. elegans rörelsemönster eller rörelse. Ett sätt att mäta healthspan är att klassificera åldrande vuxna i tre kategorier (t.ex. A, B och C) enligt deras förflyttning på plattor, med kraftig fysisk aktivitet är klass A och förlamning är klass C 7,8,13. Även om en sådan kvalitativ sortering är användbar för att avslöja skillnader i fysisk kondition, kategorierna är breda utan tydliga gränser och därmed deras poäng är föremål för försöksledaren partiskhet.
Ett växande antal trackers har förhöjda objektivitet, förfining och precisionen hos analysen av C. elegans rörelsepå fasta medier 14-18. C. elegans förflyttning på plattor är till största delen begränsad till det plan i vilket djuret kommer i kontakt med den fasta ytan av medierna. (C. elegans kan också framkalla utforskning genom att lyfta huvudet från resten av kroppen som fortfarande är i kontakt med en fast yta, placera kroppen i flera plan. Det är dock ovanligt detta beteende.) När den placeras i flytande form, detta nematod initierar en undulatory rörelse, eller simning, som har mer omfattande dimensionell rörelse, ett större utbud av hastighet och djup rörelse och en ökad incidens med åldern av främre rör sig annorlunda än bakre jämfört med djur på fasta ytor. Som en snabb analys av fysisk kondition och svar på nya miljö, kan en försöks placera ett enskilt djur i en vätskedroppe och göra dess frekvens av kropps böjar under dissekera omfattning. Videoinspelning kan underlätta nuvarande och framtida skåror i simning kraft avdjur. Men begränsar den manuella tillvägagångssätt antal funktioner som kan görs, och är helt begränsad till att ha dödat ett djur i taget.
Locomotion i vätska har mindre utforskat än förflyttning på fasta medier. I själva verket finns det få programvara alternativ som är robust och enkel att implementera i laboratoriet för att mäta förflyttning i flytande 19-24. Programvaran Celest (C. elegans Swim Test) erbjuder lättanvända och matematiska baserade åtgärder som levererar data (krökning poäng) är direkt relevanta för den typ av motion 8; (detaljerad beskrivning av särdragen och fördelarna i Restif et al. 8). Dessutom möjliggör beräknings analys klarlägga fenotypiska egenskaper som är omöjliga för det mänskliga ögat att göra mål. Här är data som exemplifierar upplösningen av denna analys tillvägagångssätt presenteras och en enkel att implementera protokoll för att spela simma försök för efterföljande celest analys beskrivs.
Protocol
1. Nematode tillväxt och hantering
- Väx C. elegans på standardpetriskålar innehållande NGM fläckig med OP50-1 Escherichia coli som näringskälla 1-3.
- Hålla kulturer i en inkubator som upprätthåller den önskade temperaturen. C. elegans växer bra från 15 till 25 ° C, med 20 ° C är standardtillväxttemperatur.
OBS: Simning är en robust fenotyp, men simma kraft kan påverkas av miljöfaktorer, inklusive föroreningar på plattorna och överhettning av kulturer och diabilder. Starka insatser för att upprätthålla stabila förhållanden bör göras. - Använd en hemmagjord nematod pick gjord av en platinatråd brand förseglas i en glasstav för att hantera överföring av enstaka djur 4.
2. Ställ upp för Swim Analys
- Använd ett integrerat system bestående av ett stereomikroskop, digital CCD-kamera, och digital videoinspelning programvara. Den CELEST mjukvara can användas på en separat dator.
- Täck mikroskop med en mörk duk (t.ex. kände) för att förhindra bländning i simma drop område på objektglas och förbättra bildkvaliteten.
- Justera mikroskopet arbetsavstånd och förstoring för att se hela simma område, och basen spegeln för att få skarp kontrast av djuren mot bakgrunden. Ställ in belysningen till mörkfält för att visualisera organ vuxna som vitt mot den svarta bakgrunden, som fungerar mycket bra för beräknings visualisering och spårning med simma analysprogram.
- Var noga med att hålla arbetsområdet, objektglas, och simma släppa mycket ren. Skräp kan störa analysen genom att täppa till den simmar fritt vuxna och tunna trådar av fiber kan detekteras som icke rörligt djur under spårning.
3. Djur Förberedelse för analys av fysisk kondition i Liquid
- Pipett 60 mikroliter of 1x M9-buffert i en 10 mm ringförtryckt på ett objektglas. Se till droppen täcker helt inuti området av ringen. Programvaran extraherar mer simning information med hjälp av denna droppstorlek som finns på en bild än det skulle göra om utnyttjande av flerbrunnsplattor.
- Plocka ensamstående vuxna nematoder och överföra dem till droppe 1x M9 buffert, vilket minimerar transport av bakterier som kan moln vätskan. Minimera bakterier genom att först placera djuren för överföring till en sida av plattan som inte innehåller mycket bakteriell gräsmatta, låta dem krypa, och sedan försiktigt lyfta upp dem.
- Vid överföring nematoderna i nedgången, använder en dissekera omfattning nära analysstationen att förkorta simma tid, vilket kan påverka beteendet hos djuren 25.
- Placera bara fyra vuxna i drop om de flyttar kraftigt och korsvägar ofta. Som vägledning för att minimera överlappande simmare (som förvirrar computational analys), överväga att placera4 djur per droppe när de är så aktiv som unga, friska WT vuxna och 5 djur per droppe när de är äldre och visar mindre kraft.
OBS: Sund WT nematoder instinktivt börja simma snart efter att ha placerats i vätska. Med hjälp av en nematod plocka, försiktigt separera vuxna i drop om de klumpar.
4. Analys av fysisk kondition i Liquid - videoinspelning av simning
- Placera objektglaset laddad med vuxna på basen av mikroskop för att spela in sitt simning. 30 s videor fånga detaljer i ett enskilt djur beteende i flytande (Video 1), och provtagning av ett stort antal sådana register är lätt åstadkommas när hjälp av CELEST programvara 8,26; Men längre simma perioder kan vara perfekt för andra specifika beteendestudier 25. Viktigt är att se till att bibehålla samma förstoringen i alla inspelningar eftersom förstoringsskillnader affect simning analys och kommer partiskhet jämförelse.
OBS: Dessa steg tillhandahålls som vägledning använder digital videoinspelning programvara som anges i tabellen Materials; VirtualDub open access mjukvaran kan ersätta, även om vi inte har testat detta.- Använd följande inställningar som vägledning för framgångsrik simma analys: bildstorlek på 696 x 520 pixlar, bildupplösning på 0,02 mm / pixel, och en hastighet av 18 bilder / s. Högre upplösning versioner av dessa inställningar kan underlätta spårning men kommer inte att påverka de åtgärder som beräknas av programmet.
OBS: Den simmar zonen som tillhandahålls av 60 mikroliter droppe av 1x M9-buffert på mikroskopobjektglaset har inte mycket djup, vilket minimerar uppåt och nedåt simning rörelse.
- Använd följande inställningar som vägledning för framgångsrik simma analys: bildstorlek på 696 x 520 pixlar, bildupplösning på 0,02 mm / pixel, och en hastighet av 18 bilder / s. Högre upplösning versioner av dessa inställningar kan underlätta spårning men kommer inte att påverka de åtgärder som beräknas av programmet.
- Under Inställningar, gå till "Inspelning", ange "Limit Sekvens Storlek" till "545 ramar på disk". Under samma rubrik, kontrollera "Använd Recording Manager rutan. Klicka på "Redigera aktuell RECORding script ... "-knappen, och under" Kommandon ", välj" Ta Frame ", och under" Stop villkor ", ange" Stanna efter 0: 00: 30.00.
- För att spela in, välj "ny sekvens i RAM" i hemmet rubriken och tryck sedan på den röda "Record" -knappen. Programvaran kommer att fånga 545 bildrutor över 30 s med digitalkameran och hålla dem i RAM-minnet.
5. Analys av fysisk kondition i Liquid - Video Behandling
- Fragmentera video till en sekvens av bildrutor genom att klicka på hemma rubriken och välja "Exportera fullständig sekvens till ..." i programvaran videoinspelning.
OBS: Den digitala videoinspelning programvara kan spara ramarna som bmp, .jpg, .tif eller .png, som alla kan läsas av programmet simma analys som presenteras här. Observera att .tif-filer använder mer lagringsutrymme, men vissa format som .jpg kan försämra bildkvaliteten. - Starta simma analysprogrammet från MATLAB by klicka på knappen sikt.
- På startskärmen på simma analysprogrammet, använda "Lägg till en video" eller "Lägg till flera filmer 'för att överföra sekvenser av bildramar en i taget eller i grupper medan knutna relevanta märkningar såsom genotyp, datum, recensioner och varaktighet . Mjukvaran skapar en databas av de märkta sekvenserna.
- Aktivera samtidig spårning av flera djur i de uppladdade sekvenser genom att klicka på "en. Process video ". I den nya skärmen, välj önskade videos i den vänstra rutan och klicka "Lägg till listan". För varje video klickar du på namnet i det övre högra listan för att visa den första bilden i videon i det nedre högra hörnet. Avgränsa simma zon genom att välja 3 punkter inne i ringen, och initiera behandling genom att klicka på "Process alla videoklipp som anges ovan. Visa utvecklingen av behandlingen i centrum botten.
- När de är färdiga, "Close" videobearbetningsskärmen.
6. Analys av fysisk kondition i Liquid - Mätning
- Klicka på "2. Beräkna åtgärder "för att öppna en ny skärm där de bearbetade videoklipp kan laddas upp, en i taget, för att bekräfta eller förkasta spårning av enskilda djur. Videoklipp som har bearbetats visas i listan till vänster där videonamn kan klickas för att ladda upp videoklippet.
- Använd denna handbok steg för att fokusera på områden av missade spårning (röda block) i motsats till framgångsrik spårning (gröna block).
OBS: Alternativt kan man lita på den automatiserade produktionen av giltiga spårning eftersom programvaran har ett robust system för spårning (94,1% giltighet som observerades i 2,020 djur från 404 videos 8).- Hitta "giltighet segmenterade kroppen" i den första färgfältet över skärmen i den nedre halvan. Procentandelen "Giltiga ramar" är i grönt, och andelen "Avvisade ramar" är i rött. ≥80% av giltiga ramar innebär att spåra information används för att beräkna åtgärder kommer från minst 432 ramar av 540 i en 30 s simma prov registrerades vid 18 bilder / s.
- Enkelt navigera och ändra block av giltig / avvisade ramar som använder "nästa block", "Switch giltighet", "Split blocket", och "Isolera ram" alternativ. I de sällsynta fall då 2 djur möttes i en uncrowded simma zon, byta deras identifikationsnummer under en viss ram rad med "Switch" knappen.
- Visa stapeldiagram i den nedre halvan av skärmen för ytterligare information om spårning och överlappande föreställningar. Längden av den segmenterade kropp (djurets kropp längd per ram) korrelerar med överlappande incidens.
- Om några ljuspunkter på video störa analysen justerar ljusa områden i simma zonen genom att välja "bländning zoner funktion.
- Klicka på "Spara och Beräkna åtgärder" för att spara giltigheten ingången innan uppläsa in ett annat bearbetade video. I detta skede programvaran beräknar, i bakgrunden (ej visas för användaren), krökning kartor över simma resultatet för enskilda djur och de parametrar som anges nedan (Video 2).
OBS: Parametrarna mäts som är inriktade på här beskrivs i tabell 1. Wave inledande hastighet, vågigt nummer, asymmetri, stretch, och curling beräknas baserat på krökningen kartor som programmet beräknar för djuren; körhastighet, penseldrag, och aktivitetsindex parametrar är inte baserade på krökning kartor. - Klicka på "Close" för att avsluta "Beräkna åtgärder" skärm.
7. Analys av fysisk kondition i Liquid - Resultat av resultat
Obs: Programvaran kan rapportera om flera åtgärder simma rörelse, som täcker från uppenbara till mycket subtila beteendemönster inte lätt görs av ögat (Video 3 och 4). härFokus ligger på 8 parametrar som normalt visar en bra dynamiskt omfång: Wave inledande ränta Body våg nummer, asymmetri, Stretch, Curling, körhastighet, penseldrag, och Aktivitetsindex.
- På startskärmen för programmet, klicka på "3. Visa resultat "för att erhålla analys utgång.
- Skapa urvalsgrupper för statistisk behandling genom att välja önskade analyserade sekvenserna av ramar i den vänstra rutan och flytta dem till en ny eller befintlig provgrupp genom att klicka på "Lägg till det valda stickprovet" eller "Lägg till nya prov" knapparna.
- Klicka på "Visa diagram för dessa prover" för att gå till en andra skärm som visar grafer och nyckeltal av proven för var och en av de 8 parametrar genom val på högst upp på skärmen.
- Om så önskas, justera representationen av stapeldiagram längst upp till vänster på skärmen med hjälp av "Colors", "# av histogram" och "# av maskar" väljare.
- Användning"2D histogram" för att rita en kombination av två valfria parametrar via "Mät på X-axeln" och "Mät på Y-axeln" rullgardinsmenyer till vänster på skärmen. Klicka på "Stäng" för att avsluta och återgå till "Visa resultat" skärm.
- Använd "Exportera ..." knappen högst upp till vänster på skärmen för att spara detaljerade sifferuppgifter som CSV-fil för att öppna och ytterligare manipulera i ett kalkylprogram.
- "Stäng" de "Visa resultat" skärmen för att gå tillbaka till startskärmen och klicka på "Avsluta" för att säkerställa spara den databas som innehåller de analyserade videosekvenser.
Representative Results
Genom att analysera rörelse i flytande (simning), kan fenotyper som inte uppenbart på fasta medier (kryper) belysas. För att kvantifiera simning förflyttning vi utvecklat särskild programvara som mäter tio nya parametrar simbeteende 8. Det åtta mest användbara av dessa parametrar beskrivs i detalj i tabell 1. Dessa parametrar heter Wave inledande hastighet, Body våg nummer, Asymmetri, Stretch, Curling, Körhastighet, penseldrag, och Aktivitetsindex. Studier exemplifierar kraften i programvaran har definierat den funktionella minskningen av hundratals äldre vuxna med WT, beteende eller livslängd mutant bakgrunder 8, och har analyserat väl studerat livslängd mutanter ålders en (hx546) och daƒ-16 (mgDƒ50) som hyser mutationer som stör den normala insulinsignaleringsvägen. Genen ålders en kodar för en phosphatidylinositide 3-kinas (PIK3) Katalytiska underenheten, och, när det hyser mutationen hx546, orsakar livslängd förlängning och stresstålighet 27-29. Genen daƒ-16 kodar för en forkhead låda O (FOXO) transkriptionsfaktor som förkortar livslängden och försämrar stress när bort 30-33.
Vissa parametrar för simning såsom Wave inledande hastighet, Körhastighet, penseldrag och Aktivitetsindex sjönk gradvis med åldern, även under gynnsamma genetiska bakgrunder (Figur 1). I linje med nuvarande kunskap, långlivat ålders 1 (hx546) mutanter visade en mer kraftfull fysisk prestation än WT vid avancerade och extremt gamla åldrar. Också som väntat, som visas kortlivade daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter äventyras prestanda, speciellt vid extremt gamla åldrar. Anmärkningsvärt var det endast under överinseende av celest datorseende och matematisk algoritm paket som Superior simma prestanda ålders 1 (hx546) mutanter kunde detekteras i början av vuxenlivet. Det faktum att ålders en (hx546) resulterar i förbättrad fysisk prestation vid unga vuxenlivet tyder på att denna mutation påverkar normal utveckling och / eller unga vuxna fenotyp på ett sätt som inte tidigare uppskattat (Figur 1).
Body våg nummer, asymmetri, Stretch, och Curling parametrar trend upp med åldern i WT och åldrande muterade vuxna (Figur 2). Intressant upplösningsnivån av programvaran avslöjade finare beteendemönster som den ihållande symmetri ålders en (hx546) mutanter hela deras livslängd och oförmåga extrema gamla daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter att sträcka och krypa upp i den utsträckning som samma -Ålder WT och ålders en (hx546) vuxna.
Förutom den övergripande oundviklig förlust av fysisk performance på grund av ålder, visar varje enskild vuxen en unik progression mönster genom åldrandet, även om genetik och miljö är praktiskt taget homogena 7. (Genom att styra genetik och miljö, är de möjliga confounding effekterna av dessa faktorer minimeras avslöja betydande bidrag stochasticity till åldersrelaterad degeneration.) En synkroniserad C. elegans population av liknande genetisk bakgrund hålls i en kontrollerad miljö fortfarande innehåller en blandning av olika klasser av individer enligt deras åldrande egenheter. Även om alla börjar som friska vuxna, vissa snabbt förlora sin kondition (dåliga chefer, klass C), medan andra upprätthålla kraft under längre tid (graciösa chefer, klass A). Dåliga chefer tycks således ha en betydligt kortare healthspan än graciösa chefer.
Som beskrivs närmare i vår studie 8, graciösa chefer underhålls ungdomlig fysisk fitnessanläess som observerades i jämförelse med simma profilen för mycket yngre vuxna (Figur 3, 4 och 5). Denna ihållande kondition är jämförbar med den fysiska prestationen av långlivade ålders 1 (hx546) mutanter vid post-fertil ålder (D 11) (figurerna 1 och 2). Tvärtom, dåliga chefer förlorade dramatiskt mycket av sin fysiska kapacitet strax efter reproduktion, utför på nivåer som liknar de extrema gamla och progeric daƒ-16 (mgDƒ50) vuxna (Figurerna 1 - 4). Dessa likheter kan dras av grov jämförelse, men vissa signaturer är lätt märkbar vid en närmare titt. Till exempel, även om det finns ett visst samband mellan omfattningen av både sträcka och curling i extrema gamla vilda typer och åldrande mutanter (Figur 2), detta förhållande är inte observerats i dåliga chefer (figurer 4 och 5), som visar högre benägenhet att krypa upp, meninte sträcka i de testade proverna. Mjukvaran presenterar vi lägger således dimension till analysen av fysisk kondition eller motoriskt kapacitet genom att tillhandahålla verktyg för mer sofistikerade studier som inte var lätthanterlig tidigare. Sammanfattningsvis, Celest erbjuder omfattande avläsning i form av åtta nya åtgärder lyfts fram här, som definierar beteende fingeravtryck av specifika genetiska, epigenetiska och miljö bakgrunder, vilket möjliggör identifiering av unika och gemensamma parameter mönster som kan vara underskrifter av särskilda villkor ( miljö, farmakologiska, närings), biologiska processer, eller organism stater som healthspan.
Figur 1: Celest Software Rapporter om Wave Inledande Rate (A), Aktivitetsindex (B), borstar slår (C) och förflyttningshastighet (D) för WT, ålders en (hx546), och daƒ-16 (mgDƒ50) Vuxna på D4 (ung vuxen), 11 (efter reproduktion) och 20 (extremt gammal). "#" I y-axeln betyder "nummer". WTS är färgade i grått, ålders ett grönt och daƒ-16 i rött. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet (SEM). Samma ålder WT och åldrande mutanter jämfördes med avseende på statistisk signifikans med användning av envägs-ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i varje datapunkt från fyra oberoende försök. Observera att här, och för figur 2, är varje enskild 30 s video gjord med 4 djur, och för varje försök vi poäng totalt 16 djur från 4 simma filmer, görs detta för 4 biologiska replikat för varje datapunkt visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Software Rapporter om Body vågtalet (A), Asymmetri (B), Stretch (C), och Curling (D) för WT, ålders en (hx546) och daƒ-16 (mgDƒ50) Vuxna på D4 (ung vuxen), 11 (efter reproduktion) och 20 (extremt gammal). "#" I y-axeln betyder "nummer". WT är färgade i grått, ålders ett grönt, och daf-16 i rött. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet (SEM). Samma ålder WT och åldrande mutanter jämfördes med avseende på statistisk signifikans med användning av envägs-ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i varje datapunkt från fyra oberoende, 30 s simma försök.e.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Software Rapporter om Wave Inledande Rate (A), Aktivitetsindex (B), borstar slår (C), och förflyttningshastighet (D) för unga WT vuxna (D 4), och med samma ålder Graceful och Bad Agers (D10 och 11). "#" I y-axeln betyder "nummer". Unga WTS är färgade i grått, klass A graciösa chefer i grönt, och klass C dåliga chefer i rött. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet (SEM). A graciösa chefer och klass C dåliga chefer jämfördes med D 4 unga vuxna med hjälp av envägs ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. ****, P <0,0001. n = 27 i varje datapunkt från två oberoende, 30 s simma försök. Diagram är något modifierad från Restif et al. (2014) 8, som publicerades under CreativeCommons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mjukvaru Rapporter om Body vågtalet (A), Asymmetri (B), och Curling (C) för unga WT Vuxna (D 4), och med samma ålder graciösa och dåliga Agers (D 10 och 11). "#" I y-axeln betyder "nummer". Unga WTS är färgade i grått, klass A graciösa chefer i grönt och klass C dåliga chefer i rött. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet (SEM). A graciösa chefer och klass C dåliga chefer jämfördes med D 4 unga vuxna med hjälp av envägs ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001;
Figur 5: Software Rapport om Stretch för unga WT vuxna (D 4), och med samma ålder Graceful och Bad Agers (D 10 och 11). Unga WTS är färgade i grått, klass A graciösa chefer i grönt och klass C dåliga chefer i rött. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet (SEM). Klass A graciösa chefer och klass C dåliga chefer jämfördes med D 4 young vuxna som använder en envägs ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. n = 27 i varje datapunkt från två oberoende studier. Diagram är något modifierad från Restif et al. (2014) 8, som publicerades under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Swimming av en representativ grupp C. elegans vuxna. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Celest Software Beräkning av individuella krökning Kartor över Swim Föreställningar av djuren. Kröknings kartor beräknas i bakgrunden; de inte visas i programvaran gränssnitt med användaren. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3: beräkningsprogram för simma åtgärder som grundar sig på Maps Enskilda krökning. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4: Software Beräkning av Swim Åtgärder som inte lita på KrökningKartor. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
Användningen av C. elegans som modellsystem fortsätter att öka på grund av dess genetiska formbarhet, experimentell spårbarhet och anatomi kommenterade till minsta detalj. Till exempel, är den neuronala strukturen och anslutning av C. elegans hermafrodit tydligt kartlagt 34-36, kraftigt underlätta undersökningar av specifika neuronala kretsar som styr speciella beteenden. 302 neuroner utgör den vuxna hermafrodit nervsystem, vilket förfarande ett brett spektrum av sensoriska input till grundläggande beteende utgångar som förflyttning. Strukturen för mer komplexa manliga nervsystemet har också beskrivits 37, möjliggör könsspecifika kretsar som måste lösas. 37
C. elegans beteende har studerats omfattande på standardiserade odlingsplattor innehållande fast media. Sedan WT C. elegans rör sig i förutsägbara sinusvågor på agar-fyllda plattor, avvikelser frånövergripande mönstret kan detekteras med ögat och scored manuellt. Detta tillvägagångssätt är emellertid föremål för den som utför experimentet kriterium och är arbetsintensiv. Hårdvaru- och mjukvaruverktyg som syftar till att spåra och mäta C. elegans förflyttning på fasta medier bort subjektivitet partiskhet och möjliggöra storskaliga studier, vilket möjliggör mer sofistikerade biologiska frågor som skall behandlas. Den senaste tidens beteende databas som skapats av Schafer lab 16 är ett utmärkt exempel på den analytiska förlängning och djup som har uppnåtts med en beräkningssystemet för transport på plattor.
När WT C. elegans är placerad i vätska, anpassar djuret snabbt sin rörelse till den nya miljön, initiera ett dopp. C. elegans simning använder ett större utbud av rörelse än krypa och kan vara mer oregelbunden 8. Program som Celest är avsett att fylla gapet för detaljerad analys av C. elegans beteende i vätska, Permimma kvantifiering av rörelserelaterade parametrar som inte är lätt mätt med FN-understödda ögat, eller som kan åstadkommas snabbare än manuell scoring. I åtta hård h en individ kan hantera upp till 200 filmer, ~ 1000 poster per dag.
Programvaran definierar simning bedöma parametrar som fungerar som en omfattande fingeravtryck av fysisk kondition och beteende. Förutom att berika förståelsen av de komplexa aspekterna av C. elegans beteende i flytande och deras bakomliggande molekylära vägar, kan detta program användas för att undersöka flera aspekter av biologi inklusive farmakologiska svaren, åldrande och distinkt beteende. Här presenteras en översikt över de kvantifierade förändringar som sker i den fysiska utförandet av C. elegans vuxna när de blir äldre är ett exempel på en sådan tillämpning av programmet (för en mer detaljerad redogörelse, se et al. Restif 8). I samband med åldrande, minskade vissa uppmätta parametrar samtidigtandra ökade eller inte konsekvent förändras i vildtypen. Trender bekräftades till stor del av beräknings profil livslängd mutanter, och de relativa profilerna för graciösa och dåliga Ager kohorter av samma ålderspopulationer hålls i enhetliga miljöförhållanden. Den höga upplösningen av programvaran kan också avslöja subtila fenotyper tidigare okänd i stor utsträckning kännetecknas mutanter (t.ex. ålders en (hx546) i figur 1).
Det finns några särskilt kritiska stegen i protokollet beskrivs. Att upprätthålla en konstant temperatur miljö mellan simma miljö och stammen plattan kulturen är viktig för simma reproducerbarhet, så praktiker är mycket uppmuntras att gå till stora ansträngningar för att undvika slumpvisa temperaturförändringar. Swim mediet bör hållas vid samma temperatur som plattorna. På samma sätt kommer noga att droppstorleken för simma bidra till reproducerbarhet. Slutligen är det klokt att tänka iavancera om avlastning av stora videofiler som ackumuleras. Behandling av bilder på en webbplats bortsett från videoinspelning datorn rekommenderas.
Användningen av programvaran presenteras här för simma analys har vissa begränsningar. Först, även om programmen kan samtidigt spåra flera djur, om mer än fem djur gemensamt analyseras, finns det en ökad risk att djuren kommer att simma över varandra i videobilder. När programmet kan inte entydigt avgöra vilka djur var som det censurerar dessa dataramar. Även om detta program funktionen ser till att data för enskilda djur är av hög kvalitet, men det begränsar genomströmningen. För det andra bör bilderna vara ganska ren, som är fri från damm, smuts och reflexer från lampor, som tillhörande signaler kan också förbrylla bildanalysen. Som nämnts i protokollet avsnitt 2.1.1, en mycket låg-tech investering som i hög grad kan bidra till bildfångst genom att eliminera komplikationer med fluktuationer in miljö belysning är att täcka scenområdet med en mörk duk som inte tillåter omgivande ljus att nå scenen. För det tredje, är programmet är optimerat för djur vid vuxen skede. Unga larver simma mycket snabbt och har små kroppar, vilket ökar programfel. Fjärde, en del av programvaran utnyttjar MATLAB, och när det finns versionsuppgraderingar och / eller uppgraderingar av operativsystem, kan vissa program länkar störas. För närvarande är programmet optimerad för användning på MATLAB 2015b och Mac OS version 10.10, men vi förväntar oss snart att skicka en version som är mer robust mot sådana förändringar. Slutligen kan video datafiler bli stor snabbt och kräver utrymme ska tilldelas.
Sammanfattningsvis är presenteras här en enkel metod som lätt kan implementeras på alla laboratorier utan större investeringar för att skapa videor av C. elegans simning för Celest analys. Dragen av programpaketet inkluderar omfattande automatisering från att spåra genomanalys, samtidigt flera djur spårning och användning av matematiska baser (dvs, krökning åtgärder) för kvantifiering av de flesta locomotion parametrar. Programvaran är öppen källkod, med kod och demos tillgängliga för allmänheten som beskrivs i Restif et al. 8. Även om programmet har avancerad datorseende analys för att spåra andra publicerade tracking system (t.ex. Greenblum et al., 2014 38) är förenliga med parametern analys av programvaran som presenteras här. Framtida förbättringar kommer att riktas mot att omvandla programvaran till en mer robust paket som inte begränsar användningen av de särskilda versioner av operativsystemen ovan (även anges i tabellen of Materials).
Acknowledgments
Celest utveckling stöddes av NIH bidrag R21AG027513 och U01AG045864. Data och några korta videorepresentationer anpassas från Restif et al. (2014) 8, som publicerades under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi tackar Ricardo Laranjeiro för manuskript hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans WT (ancestral). | |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
| OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
| Nematode Growth Medium (NGM) | For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| M9 buffer | For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| EQUIPMENT | |||
| CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
| MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
| Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
| Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
| Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |
References
- Brenner, S.
- Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans (2016).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. ASI regulates satiety quiescence in C. elegans. J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).
- Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702 (2014).
- Ibanez-Ventoso, C., et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun. 6, 8919 (2015).
- Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans. Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).
- Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
- Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS One. 8 (7), e69653 (2013).
- Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. J Vis Exp. (69), e4094 (2012).
- Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1. PLoS Genet. 6 (5), e1000972 (2010).
- Fang-Yen, C., et al. Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).
- Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).
- Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).
- Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
- Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans. Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).
- Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Ogg, S., et al. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Ziv, E., Hu, D. Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity. Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network. PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066 (2011).
- Jarrell, T. A., et al. The connectome of a decision-making neural network. Science. 337 (6093), 437-444 (2012).
- Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping. IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).
